HBV相關肝細胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平及其與肝癌的相關性

成曉梅 田紅 李想 楊潔

我國乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染患者較多,部分HBV感染者可能進展為乙型肝炎肝硬化,甚至進展為HBV相關性肝癌[1]。由于肝癌的早期診斷缺乏靈敏度、特異度高的生物學指標,很多患者在進行腹部CT檢查時已進展至肝癌晚期,嚴重影響患者生存率及生活質量,因此早期診斷及治療尤為重要[2]。隨著外科手術技術、小分子靶向藥物及生物制劑的不斷發展,肝細胞癌患者可選擇的治療手段及藥物有所增加,但治療后的復發率、轉移率較高,因此早期診斷HBV相關性肝癌并進行干預是提高患者生存率的關鍵[3]。微小RNA(miR)是一類內源性非編碼RNA,已被發現在多種細胞生理活動及腫瘤發生、發展過程中具有重要調節作用[4]。研究發現,miR-200a、miR-504在原發性肝癌患者的組織、血清中表達水平均有變化,且主要發揮抑制腫瘤細胞增殖、侵襲的作用[5-6]。白細胞介素(IL)作為一類炎癥因子,在機體內參與多種免疫、炎癥、應激等過程,其中IL-24作為一種多效性免疫調節因子,對乳腺癌、食管癌等癌細胞均具有促凋亡及抑制細胞增殖的作用[7-8]。本研究探究HBV相關肝細胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平特征及與肝癌發生的相關性。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年2月至2023年2月于空軍第986醫院接受治療且符合納入、排除標準的HBV相關肝細胞癌患者作為觀察組(n=60),另外選取同期慢性HBV感染者作為對照組(n=60)。納入標準:①符合《原發性肝癌診療指南(2022年版)》中肝細胞癌的臨床診斷標準[9];②有明確的HBV感染史、家族史及HBV相關病原學檢驗結果;③均為首次臨床診斷肝細胞癌,入組前未接受任何化療、放療或手術治療;④患者一般狀況尚好且臨床資料完整可取。排除標準:①合并任何其他類型的急、慢性感染;②合并嚴重心、肺功能障礙或衰竭;③入院治療前1個月內接受過激素、免疫調節劑等藥物治療;④合并其他類型、部位的惡性腫瘤或存在肝內及全身肝癌轉移;⑤同時參與其他臨床研究。觀察組中男性47例,女性13例,年齡為(59.5±4.0)歲。對照組中男性49例,女性11例,年齡為(58.9±4.7)歲。兩組患者性別、年齡及基礎疾病的差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究已通過醫院倫理委員會審批,所有入組患者均簽署知情同意書。

二、方法

(一)一般資料 通過門診及住院病歷系統收集患者ALT、AST、肝功能Child-Pugh分級、HBeAg、HBV DNA等一般資料。

(二)血清miR-504、miR-200a水平檢測 通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)測定患者外周血清miR-504、miR-200a水平。所有患者均于入院時采集空腹外周血5 mL,于室溫下以1500 r/min、有效半徑10 cm、離心15 min,獲得上層血清,使用血清總RNA提取試劑盒(上海滬震實業有限公司)提取血清樣本中總RNA,使用多重PCR擴增試劑盒(天根生化科技有限公司)擴增總RNA,應用反轉錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)將總RNA反轉錄為cDNA,所有步驟均按照對應商品試劑盒說明書操作。應用朗基Q2000B-實時熒光定量PCR儀(蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司)及miScript SYBR Green PCR試劑盒(德國QIAGEN公司)對miR-504、miR-200a及U6內參進行擴增,引物序列見表1。qRT-PCR每孔反應體系為20 μL,包括樣本cDNA 2 μL、miScript SYBR Green Mix 10 μL、正向、反向引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。表1中所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qRT-PCR反應體系為95℃,8 min;95℃,20 s;59℃,30 s;72℃,30 s,采集信號,共35個循環。每份樣品均設置3個重復孔,通過2-△△CT法計算患者血清中miR-504及miR-200a的相對表達水平。

表1 目標基因及內參基因引物序列

(三)血清IL-24水平檢測 應用IL-24 ELISA試劑盒(上海聯祖生物科技有限公司),經過上樣、孵育、洗板、加酶、孵育、再次洗板、顯色、終止等步驟,最終在IO-RAD全自動酶標儀(美國伯樂有限公司)上讀取各樣本中吸光度(A值),并根據試劑盒中標準品繪制的標準曲線計算出各血清樣本中IL-24的表達水平。

三、統計學分析

結 果

一、兩組患者一般資料對比

觀察組患者HBV DNA高于對照組 (P<0.05),ALT、AST、肝功能Child-Pugh分級及HBeAg陽性率兩組差異無統計學意義 (P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料對比

二、兩組患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平對比

觀察組患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平均顯著低于對照組患者(P<0.05),見表3。

表3 兩組患者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平對比(±s)

三、觀察組患者血清miR-504、miR-200a與IL-24的相關性

Pearson相關性分析表明,觀察組患者血清中IL-24水平與血清miR-504呈顯著正相關性(r=0.423,P=0.001),與miR-200a水平無明顯相關性(r=0.173,P=0.187),見圖1。

圖1 觀察組60例患者血清miR-504、miR-200a與IL-24的相關性

四、HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平與肝癌發生的相關性

Spearman相關性分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平與肝癌發生呈顯著負相關(r=-0.689、-0.383、-0.579,P=0.001、0.001、0.001)。

五、影響HBV慢性感染者肝癌發生的危險因素

二元logistic回歸分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a及IL-24水平降低均是肝癌發生的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

表4 影響HBV慢性感染者肝癌發生的危險因素

六、血清miR-504、miR-200a與IL-24水平對HBV慢性感染者肝癌發生的診斷價值分析

ROC分析表明,HBV慢性感染者血清miR-504、miR-200a與IL-24水平診斷肝癌發生的AUC分別為0.898(95%CI:0.839～0.956,P<0.01)、0.721(95%CI:0.630～0.812,P<0.01)及0.834(95%CI:0.762～0.906,P<0.01)。

討 論

HBV相關肝癌患者早期癥狀隱匿、病情進展較快,多數患者在出現嚴重癥狀及體征時已處于肝癌晚期或存在肝內、肝外多發轉移[10]。早期發現并進行外科手術干預可提高肝癌患者的生存率,對于HBV相關肝細胞癌患者,即使應用小分子靶向藥物、免疫制劑等仍難以取得良好的臨床效果。目前,臨床尚缺乏用于肝癌患者早期診斷的特異性標志物。miRNA在多種腫瘤細胞中發揮不同調節功能,其中miR-504、miR-200a等在肺癌、宮頸癌等腫瘤發生、發展過程中發揮抗腫瘤細胞增殖作用,因此被認為是重要的抗腫瘤調節因子[11,12]。此外,IL-24作為一個凋亡調節因子,對多種腫瘤細胞的促凋亡作用也逐漸受到關注[13]。

miR-200a是miR-200家族中的重要成員,其對于子宮內膜異位癥具有重要調節作用。miR-200a轉錄或表達水平降低后會降低對下游Rho激酶的抑制作用,進而促進Rho/Rho激酶通路活化、肌動蛋白收縮及應力纖維合成,最終有利于腫瘤細胞的轉移及侵襲,提示miR-200a具有一定抑癌作用[14]。miR-504在胃癌患者腫瘤組織中表達水平較高,且可能通過靶向RNA結合基序蛋白4促進抑制胃癌細胞凋亡進而加重疾病進展,但在膠質母細胞瘤中miR-504表達增高會抑制腫瘤細胞的侵襲及上皮間質轉化,且miR-504水平較低的患者生存時間較久,提示miR-504在不同類型腫瘤細胞中可能發揮不同作用[15]。IL-24是IL-10家族成員之一,廣泛分布于人體多種細胞、組織中,參與調節細胞的分化及凋亡過程。體外研究發現IL-24可促進結腸癌細胞的凋亡水平,同時能夠通過干擾腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞信號傳遞等方法抑制腫瘤生長及轉移[16]。在本研究中,HBV相關肝細胞癌患者血清miR-200a、miR-504及IL-24的表達水平均較低,且是HBV慢性感染者肝癌發生的危險因素,其中血清miR-504對肝癌發生的診斷價值最高。不同的miRNA可能通過調節肝癌發生、發展過程中的不同信號通路及關鍵節點直接或間接調控腫瘤細胞的增殖、轉移及凋亡等過程,miR-504、miR-200a可能通過影響磷脂酰肌醇3激酶通路、Notch通路等方式促進了肝癌細胞凋亡水平[17]。miR-504可能在HBV相關性肝癌早期抑制肝癌細胞的增殖及遷移作用,隨著患者HBV慢性感染加重及免疫功能缺損,miR-504表達水平呈下降趨勢并失去了對肝癌細胞的抑作用,表現為肝細胞癌患者體內低水平miR-504狀態。此外,miR-504可靶向抑癌基因p53,進一步說明了在HBV慢性感染者中miR-504降低與肝癌的發生具有相關性[18]。miR-504與IL-24表達水平具有一定正相關性,提示IL-24可能也在HBV相關肝癌的發生、發展過程中發揮抗癌特性。此外,IL-24也具有一定直接殺傷腫瘤細胞的作用,可作為免疫、炎癥調節因子在局部發揮直接抗腫瘤效應。因此,IL-24水平降低可能減弱巨噬細胞、自然殺傷細胞對肝癌細胞的殺傷作用,使機體免疫監視及免疫清除功能降低。但關于miR-504、miR-200a及IL-24可能發揮抗肝癌細胞作用的具體方式仍需進一步通過體外細胞實驗或動物模型進行探索。

綜上所述,HBV相關肝細胞癌患者血清miR-504、miR-200a、IL-24水平顯著降低,與HBV慢性感染者肝癌發生呈負相關,對于HBV相關肝細胞癌具有一定診斷價值。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。