2D-LC-IT-TOF-MS/MS 用于國產阿莫西林顆粒聚合物雜質一致性評價

李佳蕊，韓彬，張雪霞，任鳳芝，徐艷梅，閆凱，王巧，高燕霞

1.河北省藥品醫療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050021；2.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，河北 石家莊 050021；3.河北醫科大學，河北 石家莊 050017

阿莫西林是口服半合成β-內酰胺類抗生素，抗菌譜廣，是兒童及成人院外感染性疾病常用藥［1］，但其高發的過敏反應，尤其是過敏性休克，嚴重危害人民生命健康，需引起高度重視。已有研究［2-4］得知，阿莫西林過敏反應主要由聚合物引發。另有文獻［5］報道，口服阿莫西林制劑聚合物含量與制劑中水分等工藝屬性呈正相關。因此，聚合物雜質的控制，是阿莫西林顆粒關鍵質量屬性，然而該品種現行質量標準《中國藥典》2020 年版二部，未對該類雜質進行控制。

參考文獻［6］方法，同時結合《中國藥典》2020年版阿莫西林原料有關物質測定法［7］，建立C18 色譜柱-高效液相色譜法測定6 批國產制劑樣品及2批原研制劑樣品中聚合物雜質，同時分離出的雜質用二維液相-在線脫鹽-質譜聯用儀進行結構確認。

本實驗采用二維液相-閥切換-在線脫鹽-質譜聯用技術（2D-LC-IT-TOF-MS/MS ）對聚合物雜質進行鑒定［8-9］，該方法不改變原流動相條件，通過閥切換功能，棄去不能進入質譜的流動相組分，實現了目標雜質精準定位的液質聯用分析［10］，其中1stD-LC（一維液相）使用《中國藥典》該品種有關物質項下色譜條件進行分析，通過共用的組分收集環捕集目標雜質；在1stD-LC 分析結束后，收集環中的雜質依次進行2ndD-LC（二維液相）分析，其中2ndD-LC色譜柱條件是適合進入質譜分析的流動相［9-12］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

本實驗使用島津2D-LC-IT-TOF-MS/MS 系統。具體配置為LC-20AD 輸液泵，SIL-20AC 自動進樣器，CTO-20AC（柱溫箱），CBM-20A（系統控制器），DGU-20A5（在線脫氣機），SPD-M20A（二極管陣列檢測器），SPD-20A（UV 檢測器），FCV-12AH×3（流路選擇閥），FCV-14AH×2（色譜柱切換閥），LCMS-IT-TOF（離子阱-飛行時間質譜儀）和LC MS solution Ver.3.70（色譜工作站）。

1.2 試藥

阿莫西林系統適用性對照品（批號130608—201804，購買自中國食品藥品檢定研究院）。阿莫西林顆粒（規格：0.25 g，批號：F8082901、F8082902、F8 082903；規格：0.125 g，批號：F9022901、F9022902、F9 022903；廠家：河北某廠家）。原研樣品（規格：250 mg/5 mL，批號：536R；規格：125 mg/5 mL，批號：V78F；廠家：葛蘭素史克公司）。

2 方法與結果

2.1 液相色譜條件

1stD-LC 色譜條件。色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；流動相A：0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，用2 mol/L 氫氧化鉀溶液調節pH 值至5.0）-乙腈（99∶1）；流動相B：0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）-乙腈（80∶20）；先以流動相A-流動相B（92∶8）等度洗脫，待阿莫西林峰洗脫完畢后立即按表1 線性梯度洗脫［13］。

表1 梯度洗脫程序

2ndD-LC 色譜條件。色譜柱：InertSustainTMC18（2.1 mm×50 mm，2 μm）；檢測波長：230 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：20 μL；自動進樣器溫度：4 ℃；流動相：水-乙腈（70∶30）等度洗脫。

2.2 質譜條件

ESI（+）和ESI（-）離子源；接口電壓1.5 kV；霧化氣：氮氣1.5 L/min；干燥氣：氮氣10 L/min；碰撞氣：氬氣；脫溶劑管溫度：150 ℃；加熱模塊溫度：150 ℃；檢測器電壓：1.6 kV；一級質譜掃描范圍：m/z200～3 000；二級質譜掃描范圍：m/z200～1 500；校準方法：自動調諧，外標法校準質量數。

2.3 分析用樣品溶液配制

精密稱取阿莫西林系統適用性對照品，用流動相A 溶解并定量稀釋成2 mg/mL 溶液，作為阿莫西林系統適用性對照品溶液；阿莫西林顆粒活性成分為阿莫西林三水合物，為了得到更多的阿莫西林聚合物，取過效期樣品約2.5 g，置10 mL 量瓶中，加pH 6.0 磷酸二氫鉀緩沖液溶解，室溫放置72 h 后，作為阿莫西林聚合物混合溶液［14］。

2.4 1stD-LC 色譜分析

精密量取阿莫西林系統適用性對照品溶液和阿莫西林聚合物混合溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜-質譜聯用儀，記錄色譜圖。

阿莫西林系統適用性對照品溶液色譜圖如圖2所示，阿莫西林主峰、已知二聚體和三聚體的出峰時間，分別為6.637 min、28.516 min 和32.509 min。

阿莫西林聚合物混合溶液在該色譜系統中出峰如圖3 所示，阿莫西林主峰出峰時間為6.625 min，與圖1 一致，故推測28.623 min 處為阿莫西林二聚體，32.575 min 處為阿莫西林三聚體，并且檢出的雜質峰中存在阿莫西林更高聚合體的可能。

圖1 2D-LC-IT-TOF-MS/MS 雜質鑒定系統流路圖

圖2 阿莫西林系統適用性對照品溶液色譜圖

圖3 阿莫西林聚合物混合溶液色譜圖

LOOP 環捕集保留時間分別為6.625 min（阿莫西林主峰），28.623 min（未知目標雜質峰F1），32.575 min（未知目標雜質峰F2），35.480 min（未知目標雜質峰F3），37.797 min（未知目標雜質峰F4），38.397 min（未知目標雜質峰F5）的目標雜質峰，用于LC/MS-IT-TOF 測定。

2.5 阿莫西林主峰高分辨質譜

阿莫西林分子式為C16H19N3O5S，應用分子量計算軟件得理論分子量為365.104 5，質譜圖見圖4，其中m/z366.102 9 為［M+H］+，與計算分子量一致。

圖4 阿莫西林主峰質譜圖

圖5 未知目標雜質峰F1多級質譜圖：A.正離子模式一級質譜圖；B.正離子模式二級質譜圖；C.負離子模式一級質譜圖

2.6 未知目標雜質峰F1（28.623 min）

一級質譜圖中m/z731.214 2 的離子推測為［M+H］+，說明目標峰相對分子量為730.214 2，是阿莫西林理論分子量2 倍，m/z366.109 1 碎片推測為聚合位點的酰胺鍵斷裂形成的阿莫西林單體碎片。在二級質譜圖中存在m/z572.178 8 和m/z413.144 4碎片離子，說明分子中存在2個159 Da的青霉素母核。

負離子模式一級質譜圖中m/z729.200 2 的離子推測為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測28.623 min 處未知目標雜質峰為阿莫西林二聚體。

2.7 未知目標雜質峰F2（32.575 min）

一級質譜圖中m/z1 096.285 3、m/z1 134.268 7的離子，推測分別為［M+H］+和［M+K］+，說明目標峰相對分子量為1 095.313 8，是阿莫西林理論分子量3 倍，而m/z732.263 3 碎片推測為聚合位點的酰胺鍵斷裂形成的阿莫西林二聚體碎片，見圖6A。在二級質譜圖中存在m/z937.289 3、m/z778.244 5 和m/z619.211 1 碎片離子，說明分子中存在3 個159 Da 的青霉素母核，見圖6B。

圖6 未知目標雜質峰F2多級質譜圖：A.正離子模式一級質譜圖；B.正離子模式二級質譜圖；C.負離子模式一級質譜圖

負離子模式一級質譜圖中m/z1 094.297 5 的離子推測為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測32.575 min 處未知目標雜質峰為阿莫西林三聚體，見圖6C。

2.8 未知目標雜質峰F3（35.480 min）

一級質譜圖中m/z1 461.612 5、m/z1 499.579 2的離子，推測分別為［M+H］+和［M+K］+，說明目標峰相對分子量為1 460.612 5，是阿莫西林理論分子量4 倍，而m/z1 096.286 3 碎片推測為聚合位點的酰胺鍵斷裂形成的阿莫西林三聚體碎片（圖7A）。在二級質譜圖中存在m/z1 461.785 2、m/z1 302.477 1、m/z 1 144.357 3 和m/z985.311 4 碎片離子，說明分子中存在4 個159 Da 的青霉素母核（圖7B）。

圖7 未知目標雜質峰F3多級質譜圖：A.正離子模式一級質譜圖；B.正離子模式二級質譜圖；C.負離子模式一級質譜圖

負離子模式一級質譜圖中m/z 1 459.430 5 的離子推測為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測35.480 min 處未知目標雜質峰為阿莫西林四聚體（圖7C）。

2.9 未知目標雜質峰F4（37.797 min）

一級質譜圖中m/z1 826.554 4 的離子推測為［M+H］+，說明目標峰相對分子量為1 825.554 4，是阿莫西林理論分子量5 倍（圖8A）。在二級質譜圖中存在m/z1 667.472 7、m/z1 508.452 7、m/z1 349.413 6、m/z 1 190.387 6 和m/z1 031.340 5 碎片離子，說明分子中存在5 個159 Da 的青霉素母核（圖8B）。

圖8 未知目標雜質峰F4多級質譜圖：A.正離子模式一級質譜圖；B.正離子模式二級質譜圖；C.負離子模式一級質譜圖

負離子模式一級質譜圖中m/z1 824.489 2 的離子推測為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測37.797 min 處未知目標雜質峰為阿莫西林五聚體（圖8C）。

2.10 未知目標雜質峰F5（38.397 min）

一級質譜圖中m/z2 191.581 9 的離子，推測為［M+H］+，說明目標峰相對分子量為2 190.581 9，是阿莫西林理論分子量6 倍（圖9A）。在二級質譜圖中存在m/z1 096.281 8 碎片離子,為阿莫西林三聚體碎片（圖9B）。

圖9 未知目標雜質峰F5質譜圖：A.正離子模式一級質譜圖；B.正離子模式二級質譜圖；C.負離子模式一級質譜圖

負離子模式一級質譜圖中m/z2 189.563 2 的離子推測為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測38.397 min 處未知目標雜質峰為阿莫西林六聚體（圖9C）。

經上述分析結果表明，阿莫西林可產生的聚合物雜質——阿莫西林二聚體、阿莫西林三聚體、阿莫西林四聚體、阿莫西林五聚體、阿莫西林六聚體，在測試用色譜條件下，均可得到有效分離。

3 樣品測定

分別取6 批樣品，2 批原研樣品，按照“2.1”項下液相條件進樣，結果見圖10～12，有關物質測定結果見表2。

表2 有關物質測定結果 %

圖10 國產制劑有關物質色譜圖（批號：F8082901）

圖11 原研樣品有關物質色譜圖（批號：V78F）

圖12 阿莫西林對照溶液色譜圖

4 結論

本研究建立的高聚物測定方法靈敏、準確，可在檢測有關物質的同時進行聚合物的控制，其中阿莫西林四聚體、五聚體和六聚體為首次檢出。

對比《中國藥典》2020 年版二部收載的阿莫西林原料有關物質檢查方法中254 nm 檢測波長，阿莫西林各雜質在230 nm 處有更強的吸收，提高了檢測的靈敏度；同時，細化梯度洗脫條件，改善了雜質檢出量和分離效果，測定結果更加準確、真實體現產品純度。

按照建立的方法，考察自研制劑與原研樣品中聚合物雜質含量，企業內控標準中增加聚合物檢查項的樣品，產品中雜質檢出數量及含量均顯著降低，且批次間穩定。可見，全面考察產品質量，將質量標準與生產工藝緊密結合，準確尋找關鍵質量屬性，可及時排除風險，有效提高產品質量，同時確保產品質量的持續一致性。

目前，我國藥品消費市場主體仍是仿制藥，通過質量一致性評價，促進生產工藝調整、改進，進而提高藥品質量［15］，對保證用藥安全性和質量可控性都具有重要意義。