Plackett-Burman 聯用星點設計-效應面法優化龍膽苦苷脂質體制備工藝的研究

張衛敏，賈莉，趙魯亞，李麗平，李偉男

1.菏澤醫學專科學校，山東 菏澤 274000；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

龍膽苦苷（gentiopicroside，GPS）是中藥龍膽的活性成分，具有突出的抗腫瘤藥理作用，可通過MAPK/Akt 途徑抑制宮頸癌的侵襲轉移，是宮頸癌治療的潛力藥物［1］。但是，GPS 分子極性大，易被體內生物活性酶水解，在體內消除較快，實驗發現在大鼠體內半衰期僅為0.64 h，因此導致藥效發揮不良［2］。

脂質體（liposome，L）是將磷脂雙分子定向排列而成的囊泡，它以微粒形式包載水溶性藥物，是一種改善水溶性藥物體內分布的常用技術［3］。脂質體具有高效、低毒、靶向性強等優點，且作為一種成熟的藥物遞送載體已被廣泛應用于抗腫瘤、抗感染、疫苗等多種制劑的制備［4］。目前已有采用正交實驗優化載龍膽苦苷脂質體的相關報道，雖然正交優化實驗次數少，但精度低、可考察因素與水平數較少且不可預測最優實驗方案［5］。而Plackett-Burman（PBD）具有考察因素多、水平少的特點，可全面篩選顯著影響的因子。同時星點設計-效應面法（CCD-RSM）能進行交互實驗，多水平預測最優方案與結果［6］。PBD 與CCD-RSM 兩種設計方法聯合指導實驗可獲得精度更高、可靠性強的優化結果。較小粒徑的脂質體能延長體內循環時間，對藥效發揮具有積極作用，同時包封率（EE）也是影響脂質體療效的關鍵因素。本研究以粒徑（size）、包封率為指標考察載龍膽苦苷脂質體（L/GPS）的制劑學特征，采用PBD 聯用CCD-RSM 對制備條件進行篩選，能夠獲得包封率高、粒徑尺寸合適的L/GPS。

1 材料與儀器

龍膽苦苷原料藥（上海默克，CAS：0831-76-9，純度98%）；龍膽苦苷標準品（上海科興商貿有限公司）；大豆磷脂（天津富宇精細化工有限公司）；膽固醇（上海默克）；磷酸鹽緩沖液（PBS，武漢塞維爾科技公司）；其他試劑均為分析純。

XPR106DUHQ/AC 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UV2450 型紫外分光光度計（日本島津科技公司）；EXER1050 型旋轉蒸發儀（華宸儀器公司）；GHH-Q8000-P25 型高壓均質機（上海順儀儀器公司）；LC-10N-50A 型冷凍干燥機（力辰科技有限公司）；Mastersizer 3000 型粒徑儀（英國馬爾文儀器公司）。

2 方法

2.1 GPS 體外分析方法建立

精密稱取GPS 標準品，配制出質量濃度在5.0μg/mL～50.0 μg/mL 系列濃度5 個標準品溶液。根據文獻［7］報道，采用紫外分光光度法（UV-Vis），在空白脂質體無吸收的270 nm 下測定各濃度標準品溶液的吸光度（A）。以GPS 的濃度（C）為橫坐標（X），A 為縱坐標（Y）建立線性標準。分別配制5.0、25.0、50.0 μg/mL 的GPS 標準品溶液，進樣5 次，計算日內和日間精密度，采用同樣標準品濃度測定加樣回收率［8］。

2.2 L/GPS 脂質體的制備方法

采用制備載水溶性藥物脂質體的逆向蒸發法進行實驗［9］。稱取相應比例的大豆磷脂與膽固醇，加入6 mL 乙醚超聲溶解。量取3 mL 溶解有不同質量GPS 的磷酸鹽緩沖液，緩慢滴入含有脂質體原料的乙醚溶液中，在一定溫度條件下恒溫超聲10 min，得到W/O 型白色乳狀液體。放入茄形瓶后減壓除去有機溶劑，濃縮得到濃稠膠狀液體，加入5 mL PBS水化一定時間后，減壓蒸發除水，得到淡黃色液體，高壓均質后用0.22 μm 濾器過濾后冷凍干燥，即得。

2.3 L/GPS 脂質體EE 的測定

稱取一定質量L/GPS 凍干粉末溶解于pH 7.4 的PBS，放置于已活化的透析袋（10 000 Mw）中，并將該裝置放入500 mL 燒杯中，控制漏槽條件，在搖床中保持100 rpm 轉速透析2 h，取透析介質用上述體外分析方法測定A，計算游離GPS 含量（w2）。稱取同質量L/GPS 凍干粉末溶解放入甲醇破乳后稀釋，于270 nm 測定A，計算總GPS 含量（w1）［10］。按以下公式計算EE：

2.4 L/GPS 脂質體粒徑的測定

取不同條件下制備得到的L/GPS 脂質體各0.5 mL，分別用蒸餾水稀釋10 倍，吸取稀釋液1.5 mL放入粒徑樣品池中，粒徑儀預熱半小時后測定對應方法制備的脂質體粒徑。

2.5 PBD 實驗設計

根據預實驗確定主要影響因素5 個，分別為有機相與水相體積比（A）、水化時間（B）、載藥溫度（C）、磷脂與膽固醇比（D）、藥物與磷脂比（E）。采用Design-Expert 軟件進行實驗設計及數據處理，兩水平（+1，-1）進行實驗，因變量為size 與EE，設計安排見表1。

表1 PBD實驗因素與水平

2.6 CCD-RSM 優化實驗設計方案

采用逆向蒸發法制備L/GPS，PBD 實驗篩選出三種影響脂質體質量最顯著的因素，即載藥溫度（A）、藥脂比（B）、膽脂比（C）。載藥溫度為有機相與含藥溶液混合制備W/O 乳液時的溫度，以25 ℃至45 ℃為該因素的水平范圍；藥脂比為GPS與磷脂的質量比，范圍0.01 至0.05；膽脂比是膽固醇與磷脂的質量比，范圍0.3 至0.7。分別以size（Y1）與EE（Y2）為響應參數，各水平下因素值（α=1.682）進行實驗，使用Design-Expert 11 軟件進行數據處理。試驗安排見表2。

表2 CCD-RSM實驗安排

3 結果

3.1 GPS 體外分析方法建立結果

吸光度與GPS 濃度線性關系的回歸結果見圖1，表明GPS 在5.0 μg/mL～50.0 μg/mL 濃度范圍內符合線性關系要求。以50.0 μg/mL、25.0 μg/mL、5.0 μg/mL 三種濃度測定的日內精密度RSD 分別為0.71%、0.86%和1.52%（n=5），日間精密度RSD值分別為1.45%、1.62%和1.79%，RSD 均小于2.0%，顯示此種方法的日間和日內精密度較好。此種測定方法的加樣回收率結果分別為98.21%、98.37%和100.7%（n=3），可認為載體材料對GPS 含量測定無影響［11］。

圖1 GPS濃度與吸光度線性回歸關系圖

3.2 PBD 優化實驗結果

實驗結果見表3，方差分析見表4。方差分析結果中模型P 值顯著，顯示Y1、Y2擬合度較高，誤差較小。C、D 因素對粒徑（Y1）影響顯著，因素E 對包封率（Y2）影響顯著，因此選擇該三種因素進行下一步處方與工藝的篩選。載藥溫度（A）與膽脂比（C）影響脂質體的形成與穩定性，并非越高越好，并對粒徑大小極為重要，同時藥脂比（B）過高可由于包封能力的限制而降低包封率。根據實驗結果進行擬合得到Y1、Y2方程如下。

表3 PBD實驗結果

表4 實驗設計的方差分析

3.3 CCD-RSM 優化處方結果

3.3.1 實驗結果模擬擬合對A、B 和C 三種響應因素對size、EE 的影響情況進行考察，實驗結果見表5。并以Y1、Y2為因變量，A、B、C 為自變量，對實驗數據構建二次多項式回歸方程擬合。方程如下。

表5 CCD-RSM實驗結果

方差分析結果見表6。依據軟件擬合的Y1、Y2方程中方差分析結果顯示兩種擬合模型均具有統計學意義。評價指標Y1所屬方程中A2與C2對Y1有顯著影響，C2影響極顯著；在評價指標Y2中B 與A2對Y2有顯著影響，并且A2影響極為顯著。綜合表中數據確定，控制size 的因素影響大小為：C>A>B，控制EE 的因素影響順序為：A>B>C。分析原因可能為，膽脂比（C）作為影響脂質體成膜的關鍵因素，過高會導致size 過大，過低則難以形成穩定的脂質體結構，因此成為影響size 的最顯著因素。載藥溫度（A）是藥物在水化過程的溫度，溫度升高藥物溶解度增加，進而提高EE，同時溫度過高易導致脂質體泄漏，EE 降低，因此是影響EE 的最顯著因素［12］。

表6 方差分析結果

3.3.2 三維效應面圖與最優處方預測以size（Y1）、EE（Y2）作為L/GPS 質量的評價指標，擬合方程繪制得到的三維效應面圖，如圖2。根據擬合軟件分析其結構，得到最優制備條件為：載藥溫度（A）為34 ℃、藥脂比（B）為0.05、膽脂比（C）為0.52。

圖2 A、B、C對size與EE影響的三維效應面圖：（a）A與B對size的影響；（b）A與C對size的影響；（c）B與C對size的影響；（d）A與B對EE的影響；（e）A與C對EE的影響；（f）B與C對EE的影響

3.4 最優處方工藝驗證結果

將PBD 聯用CCD-RSM 篩選而得的最優方案進行可靠性和準確性驗證。制備等量的3 批L/GPS 脂質體，實驗驗證結果所得脂質體size 為（92.44±1.80）nm、EE 為（87.70±2.60）%。該L/GPS 脂質體size 較小，EE 值較高，表明經過篩選后得到的最優工藝條件制備方案可靠、可行，實驗結果展示良好的制劑學特性。

4 討論

GPS 是一種天然的環烯醚萜苷，具有突出的抗腫瘤藥理作用。但是，GPS 分子極性大，易被體內生物活性酶水解，在體內消除較快，使其廣泛應用受到限制，而脂質體可以加強GPS 在腫瘤部位的富集，解決龍膽苦苷水溶性差和生物利用度低的問題，能延長體內循環時間，提高抗癌效果，降低藥物的毒副作用，對藥效發揮具有積極作用［13］。

本研究采用的逆向蒸發法是制備水溶性藥物脂質體的常用手段，所得到的載藥脂質體包封率普遍較高［14］。該制備技術簡單，設備需求水平較低，因此適合工業化生產。正交試驗適合水平數不高的實驗，使用普通統計學方法計算實驗結果，實驗次數安排局限，無法模擬出最優條件下的未做實驗結果［15］。運用PBD 聯合CCD-RSM 設計實驗方案可全面認識實驗數據的趨勢與內涵，非線性擬合方式可在各因素下全面進行科學考察，所得最優工藝參數更可靠。該方法優勢在于，在可靠因素范圍內對未做實驗進行結果預測，簡化因素的篩選方案［16］。在脂質體制備中，載藥溫度需要控制在合適范圍內，過低導致脂質膜流動性低，難以包封藥物，過高則脂質體整體穩定性下降，藥物泄漏導致EE 降低［17］。膽脂比過高或過低也會影響脂質體的形成與最終質量，從而影響EE 與size 的大小［18］。本研究運用PBD 聯用CCD-RSM 優化篩選最優因素制備的GPS脂質體，EE 值較高，所得size 值較低，為納米級尺寸，為進一步制備龍膽苦苷脂質體奠定了基礎。