金櫻葉總黃酮提取工藝和黃酮類成分含量測定的研究

胡美英，余中霞，張繼紅，黃道明

上饒市檢驗檢測認證院藥品檢測分院，江西 上饒 334000

金櫻葉在我國西南、中南、華東等地區均有分布，系薔薇科植物金櫻的嫩葉［1］，具有清熱解毒、活血止血之功效，主治金瘡、潰瘍、燙火傷、閉經等，也常用于治療燒燙傷及外傷性出血，是古方“軍中一捻金”的主要藥味之一［2］。研究［3-6］顯示，金櫻葉中含有黃酮、三萜、酚酸、皂苷等多類化合物，具有抗炎消腫、抗腫瘤、促進血管內皮細胞生長等多種作用［7］，是民間常用一味中藥。

中藥在治療和預防疾病上發揮著重要作用。我國中藥資源種類繁多、分布廣泛、產量豐富，但很多中藥非常用部位在生產加工過程中被丟棄，資源未得到充分使用，產出與藥用失衡。金櫻葉資源豐富，藥用歷史悠久，療效確切可靠，所含的黃酮類成分具有顯著的抗腫瘤、抗炎活性［8］，但在收集時往往被扔掉，未得到充分利用，深入研究金櫻葉意義重大。本試驗以金櫻葉為研究對象，應用響應面法對金櫻葉總黃酮的提取工藝進行優化，應用HPLC 法對金櫻葉中蘆丁和槲皮素的含量進行測定，以期為金櫻葉資源的進一步開發利用奠定基礎。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；UV5500 紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）。對照品蘆?。ㄅ?11081-201202，純度99.2%）以及槲皮素（批號100081-201608，純度99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院。金櫻葉采自江西醫學高等?？茖W校植物園，經上饒市檢驗檢測認證院藥品檢測分院黃道明副主任藥師鑒定為薔薇科植物金櫻Rosa laevigataMichx.的嫩葉。

2 方法與結果

2.1 金櫻葉中總黃酮的提取工藝優化

2.1.1 標準曲線的繪制精密稱取蘆丁適量，制得濃度為0.1 mg/mL 的對照溶液。參照文獻［9］方法，于510 nm 波長處測定吸光度，得回歸方程為A=9.763C+0.032（r=0.999 8）。

2.1.2 樣品含量的測定精密稱取金櫻葉粉末1.0 g，按一定的方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下測定其吸光度值，計算其總黃酮含量。總黃酮得率=（Y-0.032）×10×V×100/（9.763×m×1 000）。式中：Y為吸光度值；10 為稀釋倍數；V 為提取液體積；m 為樣品質量。

2.1.3 單因素考察以總黃酮得率為評價指標，分別對乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%），超聲時間（30、45、60、75、90 min），提取溫度（50、60、70、80、90 ℃），液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）進行考察。結果見圖1。由圖1 可知，在以50%乙醇、超聲60 min、提取溫度70 ℃、液料比25∶1 的條件下總黃酮提取效果最佳。

圖1 單因素實驗結果：A.乙醇溶度；B.超聲時間；C.提取溫度；D.液料比

2.1.4 響應面設計在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度、超聲時間、提取溫度、液料比4 個因素為總黃酮提取影響的考察因素，設計總黃酮提取條件，設計方案和結果見表1 和表2。

表1 響應面法(Box-Behnken)試驗設計因素與水平表

表2 響應面設計結果

2.1.5 方差分析金櫻葉總黃酮的提取率對4 個考察因素的回歸方程為：Y=8.82+0.67A+0.39B+0.61 C+0.40D+0.11AB-0.39AC-0.41AD-0.25BC-0.22BD-0.30CD-0.85A2-0.88B2-1.03C2-0.51D2。結果顯示，在設定的區域內，所建立的模型達到極顯著水平（P<0.01），其中二次項中A、C、A2、B2、C2的P值均達到了極顯著水平（P<0.01），表明方程擬合較好。方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果

2.1.6 響應面分析通過Design-Expert 9.0.4 軟件繪制考察指標與自變量之間的等高線圖，具體見圖2。結果所得最佳提取工藝為：乙醇濃度53.2%、超聲時間62.95 min、提取溫度71.8 ℃、料液比25.8∶1，此條件下總黃酮得率為9.06%。

圖2 不同因素間的響應曲面圖

2.1.7 驗證試驗考慮實際操作可行性，將預測到的條件修正為：乙醇濃度53%、超聲時間63 min、提取溫度72℃、料液比25∶1，此條件下總黃酮得率為9.03%，與預測值差異無統計學意義，表明方程與實際情況擬合良好，提取工藝穩定可靠。

2.2 金櫻葉中蘆丁和槲皮素的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備取蘆丁、槲皮素對照品適量，置100 mL 量瓶中，加80%甲醇溶解，定容，搖勻，得濃度分別為316.5、88.2 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱取干燥后的金櫻葉粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入10 mL80%甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻，再稱定重量，用80%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 專屬性試驗色譜柱：Agilent Extend C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），采用梯度洗脫（0～20 min，10%→28%A；20～45 min，28%→60%A），檢測波長：360 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。分別取混合對照品溶液和供試品溶液進樣分析，HPLC圖如圖3所示，各成分分離度較好。

圖3 液相色譜圖：A.對照品；B.金櫻葉供試品

2.2.4 線性關系精密吸取混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，置10 mL 量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度。分別吸取10 μL 注入液相色譜儀測定，以濃度X 為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表4。

表4 回歸方程和線性關系

2.2.5 精密度試驗取同一份供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件重復測定6 次。結果蘆丁和槲皮素的峰面積RSD 分別為1.52%、1.98%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12、24 h 進樣分析。結果蘆丁和槲皮素的峰面積RSD 分別為1.46%、1.65%，表明供試品溶液24 h 內穩定。

2.2.7 重復性試驗取干燥后的金櫻葉粉末6 份，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定。結果蘆丁和槲皮素含量的RSD 分別為1.02%、2.36%，表明重復性良好。

2.2.8 加樣回收試驗取干燥后的金櫻葉粉末6 份，每份約0.5 g，精密稱定，加入適量的蘆丁和槲皮素對照品，測定含量并計算回收率，結果見表5，表明建立的方法準確可靠。

表5 加樣回收率測試結果

2.2.9 含量測定按“2.2.2”項下方法平行制備3 份金櫻葉供試品溶液，吸取10 μL 注入液相色譜儀測定含量，測得蘆丁含量為1.168 mg/g，槲皮素含量為0.062 mg/g。

3 討論

目前，對于中藥有效成分的提取工藝優化，主要有正交試驗法和響應面法。正交法只是試驗所用水平的某一種組合，結果具有局限性。響應面法可對系列數據進行多項擬合，能直觀地分析出各個因素之間交互關系，所得結果更精確，已廣泛用于有效成分的提取工藝優化［11］。本實驗通過響應面法優選了金櫻葉總黃酮提取工藝，所得金櫻葉總黃酮提取率為9.03%，比正交法優化的條件所得的8.67%提取率更優。此外，對于金櫻葉的研究，目前主要集中在化學成分和藥理作用方面，對其質量控制和有效成分的含量測定研究還未見報道，本試驗建立了金櫻葉中蘆丁和槲皮素2 個黃酮類成分的含量測定方法，所建立的方法準確可靠、操作簡便、重現性高、穩定性好、專屬性強，可為后續金櫻葉的資源利用、產品開發、質量控制等研究提供依據。