貴州省正安縣不同養殖模式下雞H5、H7 和H9 亞型禽流感血清學調查

何 婭，錢 林，鄧位喜，王 娜，周 林，楊玉能，鮑 娟，孫寶盛，代佳娣，經有林

（1.貴州省正安縣農業農村局，貴州遵義 563499；2.遵義職業技術學院，貴州遵義 563000）

禽流行性感冒（Avian influenza，AI）俗稱禽流感，病原為正黏病毒科的禽流感病毒，其毒力因子除HA 和NA 外，還包括NP基因及聚合酶基因等表達產物的綜合作用［1］。未裂解的HA 無感染性，只有在靶器官呼吸道及腸道組織相應的蛋白酶作用下，HA 裂解為HA1 和HA2，暴露融合肽段，通過融合進人宿主細胞。已知高致病力毒株與低致病力毒株的H 裂解位點的氨基酸序列有差異，前者為－XX－精氨酸－X－精氨酸/賴氨酸－精氨酸－（X 為非堿性氨基酸），而低致病力毒株僅有單個精氨酸，切割率極低，不易裂解。能否裂解和融合不僅取決于毒株和組織，也與宿主種類有關。

分離的H5 亞型高致病性毒株對家養鴨、鵝及野生雁和天鵝等也具有強致病性［2］。除HA 富含堿性氨基酸之外，NA 莖部26 個氨基酸缺失變短及PB2 蛋白第627 位氨基酸由谷氨酸突變為賴氨酸也可使病毒的毒力變強［3］。禽流感病毒的多數強毒株感染雞或火雞可出現病毒血癥，導致胰腺炎、心肌炎、肌炎及腦炎等。在發病后3～7 d 可檢出中和抗體，在第2 周達到高峰，可持續18 個月以上。大量病毒可通過糞便排出，在環境中長期存活，尤其是在低溫水中。病毒通過野禽傳播，尤其是野鴨。尚不清楚病毒如何在野禽群體中長年存在，有可能以低的水平維持，即使在遷徙及越冬時也是如此。加拿大20%野鴨在向南遷飛前已輕度感染病毒，中國多種野鴨也有較高的病毒檢出率［4］。

禽流感病毒可感染不同品種和日齡的禽類，且冬、春季節多發，四季可發。其中H5 和H7 亞型禽流感病毒引起高致病性禽流感被世界衛生組織（OIE）確定為A 類烈性傳染病，中國也將其列為一類疫病［5］。其主要特征為突然發病，傳播速度快，病死率高達100%，且禽流感病毒能感染人，某些毒株甚至可不經過混合重配再傳染的過程直接感染人并致死。為了掌握貴州省正安縣各種飼養模式下禽流感免疫情況，2020—2022 年對雞進行抗體監測，以期為進一步提高正安縣雞疫病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 雞血清來源

正安縣雞養殖主要為生態養殖，養殖形式為零星散養戶、養殖場、合作社等形式。2020—2022 年科技特派員下鄉時隨機抽取各種養殖模式的雞只血液制備血清進行H5、H7、H9免疫抗體檢測（表1）。

表1 雞血清樣本來源

1.2 主要試劑與儀器

一次性96 孔V 型微量反應板、禽流感H5 亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感H7 亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感H9 亞型血凝抑制試驗抗原、陽性血清、陰性血清均購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。單道及多道微量移液槍、移液槍吸頭、加樣槽、吸管、燒杯、振蕩器、恒溫箱、1%雞紅細胞懸液等由正安縣動物疫病控制中心獸醫實驗室提供。

1.3 檢測方法

根據國家《高致病性禽流感診斷技術》（GB/T 18936—2020）采用血凝抑制試驗（HI）對所采集的660 份雞血清進行禽流感病毒H5、H7 亞型抗體效價檢測，并采用同樣方法對禽流感病毒H9 亞型進行抗體效價檢測。采集SPF 公雞血液制備1%紅細胞懸液。

1.3.1 血凝（HA）試驗 按照倍比稀釋法在96 孔微量反應板的每孔中加入25 μL PBS液，在第1 孔加25 μL 抗原，反復抽打5次混勻后由第1 孔吸取25 μL 抗原加入第2 孔，混勻后吸取25 μL 加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11 孔，從第11 孔吸取25 μL 棄去，每孔均加入25 μL 1%雞紅細胞懸液與25 μL PBS 液，將反應板置于振蕩器振蕩2 min，于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，在對照孔紅細胞呈明顯紐扣狀沉于孔底時觀察結果。

1.3.2 血凝抑制（HI）試驗 根據HA 試驗測定的效價，配制4 單位（4HAU）抗原。在96 孔微量反應板的第1 孔至第11 孔加入25 mL PBS，第12 孔加入50 μL 的PBS。第1 孔加入25 μL 血清，充分混勻后吸25 μL 于第2 孔，依次對倍稀釋至第10 孔，從第10孔中吸取25 μL 棄去。第1 孔至第11 孔均加入25 μL 的4HAU 抗原，于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，每孔加入25 μL 1%雞紅細胞懸液，振蕩混勻，再于25 ℃恒溫箱中靜置30 min，在對照孔紅細胞呈明顯紐扣狀時判定結果。

1.4 結果判定

禽流感H5、H7、H9 亞型以完全抑制4HAU 抗原的最高血清稀釋倍數判為該血清的HI 效價。在陽性對照血清的HI 效價與已知效價誤差不超過1 個滴度，陰性對照血清效價不高于2log2 時，試驗成立。被檢血清HI 效價≤3log2 判為陰性；等于4log2 判為可疑；≥5log2 判為陽性。

2 結果與分析

經血凝-血凝抑制試驗檢測，2020—2022 年隨機抽檢的660 份血清H5、H7、H9 亞型禽流感總體抗體效價陽性率分別為78.90%、77.88%、79.69%，均達到國家規定≥70%的要求；2020—2022 年正安縣禽流感H5 亞型抗體陽性率分別為81.00%、79.20%、76.30%，H7 亞型抗體陽性率分別為74.00%、77.90%、82.00%，H9 亞型抗體陽性率分別為78.64%、70.00%、84.00%，H5 亞型抗體水平呈逐年下降的趨勢，H7 亞型抗體水平呈逐年升高的趨勢，H9 亞型抗體水平呈先降低后升高的趨勢，均達到國家規定≥70%的要求（表2）。

表2 2020—2022 年正安縣隨機抽檢血清禽流感抗體監測結果

3 小結與討論

血凝抑制試驗檢測禽流感抗體是廣泛應用的一種方法，具有操作簡便、檢測量大、敏感性好等優點［6］。試驗通過對貴州省正安縣禽流感病毒抗體檢測發現，該地區禽流感病毒抗體檢測合格率符合國家標準，得益于貴州省正安縣積極的防疫檢疫工作。馬衛紅等［5］檢測發現，2017 年惠水縣高致病性禽流感H5 亞型免疫抗體合格率為70.93%，H7 亞型免疫抗體合格率僅為29.33%，H7 免疫合格率較低。王兵等［6］2018 年對貴州省部分地區高致病性禽流感H5 和H7 亞型免疫抗體檢測發現，被檢測地區H5 亞型免疫抗體合格率為68.1%，H7 亞型免疫抗體合格率為65.75%，都沒有達到農業農村部的要求，與本試驗的貴州省正安縣禽流感免疫抗體檢測結果存在差異。比較發現，貴州省正安縣高致病性禽流感H5、H7、H9 亞型免疫抗體的合格率較高，H5、H7、H9 亞型禽流感總體抗體效價陽性率分別為78.90%、77.88%、79.69%，建議貴州省正安縣在維持免疫水平的基礎上，建立嚴格的衛生管理制度。禁止雞和水禽混養，養雞場與水禽飼養場應間隔3 km以上，且不得共用同一水源［7］。養禽場要有防止禽鳥（包括水禽）進人飼養區的設施，防止一切帶毒動物特別是鳥類以及被污染物品接觸本地雞群，并有健全的滅鼠設施和措施。同時防止人員、來訪客、飼養用具等雜物的間接傳播，對外來欲接觸雞的人員及車輛進行嚴格消毒，嚴格執行衛生消毒管理制度，注重飼料來源安全，不從疫區購進種蛋和雞苗，新購進的雞、雞苗、孵育的小雞必須接種疫苗，并隔離觀察2 周以上［8］。

結合實際制定科學的免疫措施，并根據正安縣當地疫病流行情況、飼養類型進行免疫接種，疫苗免疫接種應選擇相同亞型的禽流感疫苗按免疫程序對家禽進行預防接種，研制與使用的疫苗有禽流感滅活疫苗（H5N2 亞型、H5N1 亞型、H9 亞型）、禽流感（H5N2 +H9N2）二價滅活疫苗、重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1 亞型，Re-1 株）和禽流感-新城疫重組二聯活疫苗（rL-H5 株）、禽流感-雞痘重組二聯活疫苗（rFPV-H6 株）［9］。以上疫苗應按照一定的免疫程序接種，對產蛋雞，20～30 日齡進行首免，頸部皮下注射0.3～0.5 mL，開產前20 d 進行二免，胸肌注射0.5 mL；種雞及禽流感高發地區，在300 日齡進行三免，或在雛雞10～12 日齡用禽流感新城疫重組二聯活疫苗（rL-H5 株）滴鼻首免，以后可選擇活疫苗或滅活苗免疫。對商品肉仔雞，要根據需要確定是否接種［10］。

注意免疫監測，當抗體滴度大于5log2 時雞群才能得到保護［11］。同時做好疫情流行的應急準備工作，一旦發生或疑似高致病性禽流感，應及時報告疫情，正確診斷，追蹤調查，采取隔離、限制移動等措施，劃定疫點、疫區和受威脅區，嚴格封鎖［12］。疫區內所有禽只以不放血方式撲殺，并對所有病死禽、被撲殺禽、禽類產品、排泄物、被污染飼料、墊料、污水等按國家規定進行無害化處理，對被污染的物品、交通工具、用具、禽舍、場地進行嚴格徹底消毒，對受威脅區內所有易感禽類采用國家批準使用的疫苗進行緊急強制免疫接種，建立完整的免疫檔案［13］。發生低致病性禽流感時，可在嚴密隔離的條件下，進行必要的藥物治療，以減少損失［14］。配合應用清熱解毒、止咳平喘的中藥如板藍根、大青葉、連翹和清瘟散等，效果更好［15］。由于該病常并發或繼發大腸桿菌或支原體感染，因此適當應用抗菌藥物，如氟苯尼考、強力霉素、環丙沙星、利高霉素等，以減少死亡。要有計劃、有組織地收集檢測信息，按照要求進行監測，建立和完善禽流感監測系統［16］。