白術內酯Ⅰ通過調控Notch信號對白塞氏病小鼠脾臟Th17/Treg細胞平衡和細胞凋亡的影響?

吳紫陸,趙 斌,丁 虹,蔡紀堂△,宋會玲

(1.河南中醫藥大學 第二臨床醫學院,鄭州 450002;2.河南省中醫院,鄭州 450002)

白塞病(Behcet’s disease, BD)是一種以血管炎性疾病為主要病理表現的自身免疫性疾病[1]。作為機體最大免疫器官的脾臟是免疫反應的中心,與機體免疫狀態有密切關系。最新研究表明,T細胞在BD的發病過程中發揮重要作用。其中輔助性T細胞(T helper cells, Th)17與調節性T細胞(T regulatory cell, Treg)比例失衡以及淋巴細胞過度凋亡,在白塞病發病機制中起著關鍵作用[2-3]。

目前有關白塞病的早期治療主要使用扶正補益類藥物,其中白術(Atractylodes macrocephala)既可補氣健脾、燥濕利水;又兼以養陰避免滋膩太過[4]。現代藥理學研究表明,白術的主要成分主要包含白術多糖、白術內酯、白術氨基酸及蒼術酮等,其中白術內酯I具有抗炎、調節免疫、改善胃腸道功能以及抗腫瘤的效果[5-6]。跨膜受體蛋白Notch信號通路在維持機體免疫平衡中具有重要作用,Notch廣泛表達在CD4+T細胞表面,它不僅能夠調控Th17/Treg平衡和細胞凋亡,還可以調節白細胞介素(interleukin, IL)-10和IL-17等抗炎因子的分泌[7-9]。本研究旨在探討Notch信號在白術內酯Ⅰ改善白塞氏病小鼠脾臟中Th17/Treg細胞失衡和細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級小鼠40只,雌雄各半,6～8周齡,體質量(20±5)g,購自鄭州大學實驗動物中心。動物許可證號:SCXK(豫)20210007。實驗前所有動物均于室溫20～25 ℃、普通飼料、自由進食飲水環境下適應性喂養1周。所有動物實驗均經河南中醫藥大學第二臨床醫學院動物保護與倫理委員會批準,實驗動物許可證號PZ-HNSZYY-2021-001。

1.2 藥物

白術內酯Ⅰ購自成都普菲德生物技術有限公司,規格10 mg/支,貨號:JOT-10489。

1.3 主要試劑與儀器

Percoll細胞分離液購自北京Solarbio公司,貨號LA9510;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自翌日圣生物科技(上海)股份有限公司,貨號40306ES20;IL-4 ELISA試劑盒(貨號mL064310)、IL-10 ELISA試劑盒(貨號mL064299)、IL-17 ELISA試劑盒(貨號mL063129)、IL-22 ELISA試劑盒(貨號mL063138),均購自上海酶聯生物科技有限公司;維甲酸相關孤兒受體(Retinoic acid-related orphan receptor, ROR)γt抗體(貨號16450S)、叉頭框蛋白 P3(Forkhead Box Protein P3, Foxp3)抗體(貨號12653 T)、Notch1抗體(貨號3608 S)、Hes1抗體(貨號11988 S)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, caspase-3)抗體(貨號9662 S)、β-actin抗體(貨號4970 T),均購自美國Cell Signaling Technology生物公司;FITC-anti-mouse CD4(貨號100406-1),percp-cy5.5-anti-mouse IL-17(貨號506920-1),PE-anti-mouse Foxp3(貨號126403-1)、APC-anti-mouse CD25(貨號162106),均購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

Gallios型流式細胞儀,美國beckman公司;Varioskan型酶標儀,美國Thermo公司;164-5050型基礎電泳儀、170-3930型轉膜儀,美國Bio-Rad公司。

1.4 模型建立[10]

將40只SPF級小鼠隨機分為對照組、模型組、白術內酯I(40 mg/kg)組和Jagged1(1 mg/kg)組,每組10只。0.1 mL原肌球蛋白為致敏原,以0.1 mL弗氏為佐劑,濃度0.6 mg/mL,模型組與實驗組20只小鼠腹腔注射0.5 mL,每周1次,共4次,對照組小鼠腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 分組及給藥方法

小鼠分組后,對照組與模型組小鼠給予等劑量濃度0.9%的0.9%氯化鈉溶液,白術內酯I組給予白術內酯I (40 mg/kg);Jagged1組給予Jagged1 (1 mg/kg),2次/日,灌胃連續給藥4周,所有SPF小鼠均在同等條件下飼養。末次給藥后1周,取小鼠新鮮脾臟組織,用于后續實驗。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 Western Blot檢測小鼠脾臟中Notch1、Hes1、Foxp3和RORγt蛋白表達水平 稱取脾臟組織50 mg,研磨勻漿后加入RIPA裂解液在冰上裂解,4 ℃, 12000 r/min離心15 min,提取蛋白上清液,按比例加入上樣緩沖液后于水浴鍋內100 ℃煮沸10 min變性。蛋白定量試劑盒(Bicinchoninicacid, BCA)法檢測蛋白濃度。電泳轉膜后用含有5%脫脂奶粉的封閉液4 ℃封閉2 h。用抗體稀釋液稀釋一抗,Notch1(1:1 300);Hes1(1:1 200)、Foxp3(1:1 000)、RORγt(1:1 000)、β-actin(1:3 000),將聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜浸泡于一抗中,4 ℃孵育過夜,TBST充分洗滌3次;加入二抗室溫孵育2 h,TBST充分洗滌3次,加入化學發光底物(electro-chemi-luminescence, ECL)顯影,凝膠成像系統掃描拍照,用Image-J分析條帶灰度值,測定蛋白表達水平。

1.6.2 流式細胞術檢測小鼠脾臟中Th17/Treg細胞平衡情況 使用Percoll液分離1.5項下脾臟組織的單核細胞,調整細胞濃度(1×106/mL),分別通過加入CD4-FITC、CD25-APC、IL-17PE和Foxp3-PE進行來進行染色;分別避光孵育30 min后上流式細胞儀檢測檢測Th17與Treg細胞的比例。

1.6.3 ELISA法檢測小鼠脾臟中的含量IL-17、IL-22、IL-4和IL-10的水平 取50 mg脾臟組織,用預冷后的PBS進行洗滌,勻漿后離心分離上清液,于-80 ℃冰箱中凍存備用。參照ELISA試劑盒說明書步驟,檢測小鼠脾臟上清液中IL-17、IL-22、IL-4和IL-10的水平。

1.6.4 TUNEL法檢測小鼠脾臟中陽性細胞凋亡數 取各組小鼠脾臟組織充分脫蠟(60 ℃, 20 min)后水化(梯度乙醇浸洗),使用蛋白酶K孵育(20 min),參照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟,檢測小鼠脾臟組織中TUNEL陽性細胞凋亡數。截取高倍鏡下圖像,計數高倍鏡下TUNEL陽性細胞凋亡數量,并計算其與TUNEL細胞總數的比例。

1.6.5 免疫組化法檢測小鼠脾臟中caspase-3蛋白表達水平 取各組小鼠脾臟組織石蠟切片,脫蠟及水化后高壓熱修復抗原;3% H2O2孵育(37 ℃, 10 min),常規洗滌吸干后加入血清封閉;滴加Caspase-3抗體(1:100),孵育過夜(4 ℃);常規洗滌后滴加二抗(1:100)(37 ℃, 30 min);常規洗滌吸干后滴加二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)工作液顯色,光學顯微鏡下隨機觀察每張切片的不同視野,Image J分析單位面積內Caspase-3染色的平均光密度值。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟Notch通路蛋白表達的影響

Western blot結果表明,與對照組比較,模型組小鼠脾臟中Notch通路蛋白Notch1和Hes1的表達明顯增高,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,白術內酯I組脾臟中Notch通路蛋白Notch1和Hes1的表達明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與白術內酯I組比較,Jagged1處理組小鼠脾臟中Notch通路蛋白Notch1和Hes1的表達明顯增高,具有統計學差異(P<0.05),結果見圖1。

2.2 白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟中Th17、Treg淋巴細胞比例的影響

流式細胞術結果表明,與對照組比較,模型組小鼠脾臟中Th17細胞比例及Th17/Treg比值明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05),Treg細胞比例則較對照組明顯降低(P<0.05);與模型組比較,白術內酯I組脾臟中Th17細胞比例及Th17/Treg比值明顯降低,而Treg細胞比例明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05);與白術內酯I組比較,Jagged1處理組小鼠脾臟中Th17細胞比例和Th17/Treg比值升高,Treg細胞比例降低,具有統計學差異(P<0.05),結果見圖2。

注:與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術內酯I組比較△P<0.05

2.3 白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟Th17和Treg相關細胞因子表達的影響

與對照組比較,模型組小鼠脾臟中Th17細胞因子IL-17和IL-22的水平明顯升高,而Treg細胞因子IL-4和IL-10的水平明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,白術內酯I組小鼠IL-17、IL-22水平明顯降低,而IL-4和IL-10的水平明顯升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。與白術內酯I組比較,Jagged1組中IL-17和IL-22的水平升高,而IL-4和IL-10的水平降低,差異顯著(P<0.05),結果見圖3。

注:與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術內酯I組比較△P<0.05

2.4 白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟Foxp3和RORγt蛋白表達的影響

與對照組比較,模型組小鼠Foxp3水平明顯降低,而RORγt表達水平明顯升高,具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,白術內酯I組小鼠Foxp3水平明顯升高,RORγt表達水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與白術內酯I組比較,Jagged1組小鼠脾臟中Foxp3水平降低,RORγt表達水平升高,具有統計學意義(P<0.05)。結果如圖4。

注:與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術內酯I組比較△P<0.05

2.5 白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟細胞凋亡的影響

與對照組比較,模型組小鼠TUNEL陽性細胞數明顯升高,具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,白術內酯I組小鼠脾臟TUNEL陽性細胞數明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);與白術內酯I組比較,Jagged1組小鼠脾臟中TUNEL陽性細胞數升高,具有統計學意義(P<0.05)。結果如圖5。

2.6 白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟中caspase-3水平的影響

免疫組化結果表明,與對照組比較,模型組小鼠凋亡執行蛋白caspase-3陽性細胞數明顯升高,具有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,白術內酯I組小鼠脾臟caspase-3陽性細胞數明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05);與白術內酯I組比較,Jagged1組小鼠脾臟中caspase-3陽性細胞數升高,具有統計學意義(P<0.05)。結果如圖6。

注:與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;與白術內酯I組比較△P<0.05

3 討論

BD又稱口、眼、生殖器三聯征,臨床表現多以反復性口腔潰瘍、眼部炎癥、外陰潰瘍及皮膚損害為主。中醫古籍對此并無詳細記載,但依據其臨床表現可歸納于“狐惑病”。《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病脈證治》最早記載為“狐惑之為病……蝕于喉為惑,蝕于陰為狐……狐蝕于上部則聲嘎”[11]。中醫認為脾位中焦,主運化水谷精微,為人體后天正氣之本,氣血生化之源,氣機升降出入之樞紐,脾臟異常與否與BD的發病有密切關系[12]。徐玲擬黃芪補中湯健脾溫陽治療BD,方中以白術、蒼術、豬苓、茯苓及澤瀉助黃芪、人參補益脾氣而助運降[13];王新陸對于BD的治療則擬白術、陳皮健脾運濕,絕生濕之源[14]。白術內酯Ⅰ是白術的主要活性成分之一,具有廣泛的生物和藥理學活性[15]。

免疫細胞的紊亂與BD的形成和發展密切相關。Th17和Treg細胞是近年新發現的CD4+細胞亞群,兩者相互拮抗[16]。研究發現,BD患者血清中由Th17產生的細胞因子IL-17水平明顯升高。此外,IL-22是臨床常見的炎性因子,IL-22可以促進Th17細胞的分化,在BD發病過程中明顯升高[17]。Treg可以通過分泌IL-10 來抑制Th17細胞的活化。細胞因子IL-10能夠抑制T淋巴細胞的成熟與分化,降低機體炎癥反應,從而緩解BD癥狀[18]。Th17細胞的重要因子RORγt可以有效引導增多IL-17的分泌,在皮膚與黏膜的生理及病理過程中都發揮著重要作用,通過誘導上皮細胞、成纖維細胞等多種細胞因子刺激炎癥的產生并使其加重[19-20]。高水平的IL-4也是白塞病發病的重要因素之一,其參與調節Th17/Treg比例的平衡。Hamzaoui等[21]發現,BD患者外周血中IL-4和IL-10的水平有顯著降低。此外,RORγt和Foxp3蛋白相互拮抗,在兩者的共同作用下來維持Th17/Treg細胞比例的平衡[20]。本研究結果表明,白術內酯Ⅰ治療后,BD小鼠脾臟Th17細胞比例及Th17/Treg比值明顯降低,而Treg細胞比例明顯升高。白術內酯I處理后,BD小鼠脾臟中RORγt和Foxp3蛋白比例逐漸恢復正常。綜上,這些結果表明,白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟Th17/Treg細胞比例的失衡具有改善作用。

近年來的研究發現,細胞凋亡在免疫性疾病的發生發展過程中占有重要地位[22]。張誼之等[3]研究發現,白塞病皮損中會伴隨較多淋巴細胞的凋亡。本研究結果也表明,BD小鼠脾臟細胞凋亡比例升高,而經白術內酯I治療后,BD小鼠脾臟中TUNEL陽性細胞數和凋亡執行蛋白caspase-3的表達水平均明顯降低。

Notch信號可以調節CD4+T細胞分化為Th17和Treg細胞,在自身免疫性疾病的發病機制中起著重要作用[23-24]。此外,有研究也表明Notch信號在調控細胞凋亡的過程中也起著重要作用,Jagged1是哺乳動物細胞膜上Notch受體的主要配體蛋白之一,與細胞表面Notch結合后,能夠通過細胞間的相互作用激活Notch信號[25-28]。在BD鼠中可以觀察到Notch信號的異常活化,并且抑制Notch信號活化可以起到治療BD的作用[29]。本研究結果表明,BD會激活小鼠脾臟中的Notch信號。為了進一步探究白術內酯I是否通過調控Notch信號來改善BD小鼠脾臟Th17/Treg比例失衡和細胞凋亡,本研究采用Notch信號通路激活劑Jagged1激活Notch信號通路,結果表明,Jagged1可顯著減弱白術內酯I對白塞氏病小鼠脾臟Th17/Treg細胞穩態和細胞凋亡的改善效果。

綜上,白術內酯Ⅰ對BD小鼠的治療作用與其改善脾臟Th17/Treg細胞比例失衡以及降低脾臟細胞凋亡有關,其作用機制可能與抑制Notch信號的活化有關。