中醫藥調控信號通路治療骨肉瘤的研究?

楊浩東,謝興文,李 寧,△ ,李鼎鵬,丁聚賢,柳 博,袁可馨,劉 凱,姚乾寧

(1.甘肅中醫藥大學,蘭州 730000;2.甘肅中醫藥大學附屬醫院,蘭州 730000;3.甘肅省第二人民醫院,蘭州 730030)

骨肉瘤是臨床常見的骨惡性腫瘤,以兒童和青少年為主要發病人群,其中男性的發病率遠高于女性,患者5年生存率低于50%[1-3]。骨肉瘤的疾病特點為好發于人體的長骨干骺端,以股骨遠端和脛骨近端發病較為多見,容易發生局部侵襲和早期肺轉移[4]。目前其發病機制尚不明確,并且可供選擇的治療方式也十分有限[5-6]。現代醫學所采用的新輔助化療結合保肢術的治療方式雖提高了骨肉瘤的治療效果,但仍有許多患者療效不佳,經常出現腫瘤復發或腫瘤細胞向肢體遠端轉移。這些問題的產生和發展涉及多基因參與、多信號通路交叉作用的復雜過程,同時與長期使用化療藥物使得腫瘤細胞對藥物的敏感度降低有關[7]。此外,化療藥物的不良反應較大,治療費用也較為昂貴,因此,該療法具有一定的局限性。

近年來,中醫藥在腫瘤相關疾病的防治中發揮了越來越重要的作用,并且以其獨特優勢和確切療效受到了廣泛關注[8-10]。相關研究發現,中醫藥具有多生物活性成分、多靶點、多通路協同作用、高效價廉和不良反應小等優勢,能夠有效抑制腫瘤生長和新血管的生成并逆轉腫瘤細胞對抗癌藥物的多藥耐藥[11-14]。隨著骨肉瘤發病機制研究的日漸深入,近年來已發現細胞內的多條信號通路都與該病的發生和發展密切相關,信號通路通過改變其下游信號分子的活化狀態,從而誘導靶基因表達以影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、自噬、侵襲、細胞周期及腫瘤新生血管的生成[15-16]。本研究通過對應用中醫藥調控分泌型糖蛋白(Wnt)、神經源性位點缺口同源蛋白(Notch)、核轉錄因子(nuclear factor,NF)-κB、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB別名Akt)、有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)、Janus激酶(janus kinase,JAK)/信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)等信號通路治療骨肉瘤的文章進行分析、整理,闡明中醫藥治療骨肉瘤與相關信號通路之間的關系,以期為中醫藥治療骨肉瘤提供參考。

1 Wnt 信號通路

Wnt信號通路是細胞內的一條高度保守的信號通路,在組織胚胎的發育過程中扮演著十分重要的角色[17]。Wnt通路根據下游激活物的不同被分為β-鏈蛋白(β-catenin)激活基因轉錄的經典Wnt信號通路、Wnt/Ca2+信號通路和與細胞骨架重排相關的Wnt/平面細胞極性(planar cell polarity,PCP)通路,其中Wnt/β-catenin是研究最多的一條通路,此條信號通路能夠調控腫瘤細胞的增殖、凋亡和細胞間質化等多個生物學功能[18]。相關研究證實,Wnt/β-catenin信號通路參與了腫瘤細胞的發生發展以及化療耐藥等過程[19-20]。在骨肉瘤細胞中,Wnt信號通路常被異常激活并促進腫瘤細胞的增殖和發生早期肺轉移[21],而且常規化療方案的失敗也與 Wnt/β-catenin 信號通路的激活有關,通過抑制Wnt通路的活性可以有效阻止骨肉瘤細胞自我更新、減緩腫瘤生長和侵襲等過程。

李國湘等[22]的研究表明,半枝蓮堿溶液(scutebarbatine,SBT)能夠減少Wnt/β- catenin信號通路中關鍵分子β-catenin的蛋白表達,從而使下游原癌基因和細胞周期素(Cyclin)D1蛋白質表達水平降低,并且SBT可抑制糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase,GSK)-3β被GSK-3β第9位絲氨酸(Ser9)磷酸化,從而促進了GSK-3β對β-catenin蛋白的降解,通過阻滯Wnt/β- catenin信號通路的傳導達到抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用。李增等[23]發現石見穿多糖可以通過降低細胞中β-catenin mRNA及波形蛋白(Vimentin)等表達,從而促進E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達來抑制上皮間質轉化過程,從而達到抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的作用。董伯升等[24]研究丹參酮ⅡA對荷骨肉瘤裸鼠的影響,發現丹參酮ⅡA低、中、高劑量各干預組血清中的白細胞介素(interleukin,IL)-2、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的表達水平、腫瘤組織中Dickkopf相關蛋白(Dkk)-1和Dkk-1 mRNA的表達均依次升高,而血清中可溶性血管細胞黏附因子(soluble vascular cell adhesion molecule,sVCAM)-1表達水平及腫瘤組織中β-catenin蛋白的表達依次降低,提示丹參酮ⅡA可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性發揮抗骨肉瘤的作用。

2 Notch 信號通路

Notch信號通路是重要的細胞間通信系統,可程序性地調控細胞命運和組織分化。在Notch信號通路中有4種主要的受體,分別是Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。這些受體是跨膜蛋白家族的成員,有著相似的結構,包括胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域,它們在細胞間的相互作用中起著關鍵的調節作用。除此之外,Notch 信號通路還擁有 5 種配體:Jagged1、Jagged2,Delta1、3、4[25]。Notch信號通路的激活是通過配體和跨膜受體的結合來完成的,一旦配體與受體結合,跨膜 Notch 受體蛋白會被γ-分泌酶裂解,使Notch受體的細胞內結合域(notch intracellular domain,NICD)釋放出來,并遷移到細胞核,與DNA結合蛋白胞內效應分子(CBF-1/Suppressor of hairless/Lag,CSL)、核轉錄激活蛋白家族(mastermind-like,MAML)和轉錄激活因子相結合,從而誘導下游Hes等目標基因的表達,產生生物學效應。因此,通常將Hes-1作為Notch1通路激活的生物標志物[26]。相關研究發現,Notch信號通路在不同生理過程中維持穩態對保證生物體內微環境的正常運轉至關重要,一旦 Notch 信號發生改變,就會導致疾病的發生[27-28]。李珂等[29]觀察Notch信號通路在γ-分泌酶阻斷劑和激動劑Jagged1的影響下對人骨肉瘤細胞的影響,發現γ-分泌酶阻斷劑能夠明顯抑制143B細胞和 MG-63細胞的增殖,且呈現濃度依賴性,而Jagged1能促進腫瘤細胞的增殖,證實了可以通過抑制Notch信號通路的激活來影響腫瘤細胞的增殖,從而達到治療骨肉瘤的效果。

梅紅軍等[30]探究不同濃度的黃芩素對143B骨肉瘤細胞增殖的抑制作用,發現骨肉瘤細胞被黃芩素處理后,細胞中B淋巴細胞瘤(B cell leukemia iymphoma,Bcl)-2相關X基因(Bcl-2 associated X protein gene,Bax)水平顯著升高,Bcl-2蛋白水平顯著降低,并且細胞中的分叉毛發與增強子(hairy and enhancer of split,Hes)家族成員Hes-1和NICD1的蛋白水平也顯著降低,提示黃芩素可誘導細胞周期阻滯,并能通過促進細胞凋亡來抑制骨肉瘤細胞的增殖,其機制可能與抑制Notch信號通路活性有關。徐慧等[31]探究不同濃度的三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)對人骨肉瘤U2OS細胞的影響,發現PNS通過阻斷Notch信號通路從而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移并促進其凋亡。亦有研究發現,蟲草素可通過促進人骨肉瘤MG-63細胞中切割型胱天蛋白酶(cleaved Caspase)-3、9和Bax蛋白的表達,并降低Bcl-2、NICD1和Hes1蛋白的表達,停滯細胞周期,誘導腫瘤細胞凋亡從而起到抗骨肉瘤的作用,這一途徑可能與蟲草素下調Notch信號通路的活性有關[32]。

3 NF-κB 信號通路

NF-κB轉錄因子家族由5個普遍表達的成員(p50、p52、p65/RelA、RelB和c-Rel)組成,形成同源或異源二聚體。在正常情況下,非活化狀態下的NF-κB在胞漿內與抑制蛋白κB(inhibitoryκB,IκB)家族的抑制蛋白相結合[33]。當細胞受到外界刺激,如在機體發生炎癥、產生腫瘤以及免疫功能改變的情況下,活化蛋白激酶并釋放NF-κB,自由的NF-κB進入細胞核,調控其所編碼的靶基因蛋白轉錄表達。相關研究表明,骨肉瘤細胞的增殖與NF-κB蛋白的表達水平呈正相關,并且能夠促進骨肉瘤細胞的轉移和侵襲[34]。

董嵩等[35]探究不同濃度甘草次酸對人骨肉瘤細胞MG-63的抑制作用,發現甘草次酸能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖,并且促進腫瘤細胞的凋亡,蛋白印跡檢測結果顯示高濃度甘草次酸組中NF-κB蛋白的表達量明顯低于其他組,提示其抗腫瘤機制可能通過影響NF-κB信號通路實現。范兆陽等[36]的研究表明石斛酚能夠有效抑制人骨肉瘤U20S細胞的增殖、遷移及侵襲,抑制細胞中TNF-α、IL-6、NF-κB、促肝再生磷酸酶蛋白(phosphatase of regenerating liver,PRL)-3等的表達,減少炎癥因子分泌,其作用機制與石斛酚調控NF-κB信號通路有關。江波等[37]研究松乳菇多糖對人骨肉瘤細胞Saos-2的影響機制,發現松乳菇多糖可以顯著降低細胞的增殖率和侵襲、遷移數,提高細胞凋亡率,其抗腫瘤作用機制可能與下調NF-κB信號通路蛋白的表達水平, 以及抑制COX-2蛋白的表達有關。

4 PI3K/Akt信號通路

PI3K是一種由調節亞基P85和催化亞基P110的異源二聚體構成的脂質激酶,根據其結構可分為PI3K Ⅰ,PI3K Ⅱ和PI3K Ⅲ,當前對PI3K Ⅰ的研究最為廣泛,PI3K Ⅰ能被細胞表面的受體激活,分為IA和IB兩個亞型,IA在腫瘤細胞中最為常見,具有蛋白激酶和類脂激酶的雙重活性,在細胞膜的信號轉導、膜轉運和代謝等過程中具有十分關鍵的調節作用[38-39]。Akt是PI3K下游非常重要的活性信號靶點,由Pleckstrin同源結構域(pleckstrin homology,PH)、催化域及調節域3部分構成。PI3K作為脂質激酶,與被磷酸化的酪氨酸殘基締合,激活自身的催化亞基p110,將磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate,PIP)2磷酸化生成PIP3[40],誘導Akt三級結構的構象發生改變,PIP3作為第二信使將Akt轉運到質膜上,將Akt的磷酸化殘基磷酸化,從而完全激活Akt,使其成為有活性的激酶進一步調節下游信號分子[41]。PI3K/Akt信號通路在細胞內廣泛存在,并能夠被多種蛋白受體激活并參與調控細胞內的許多過程,包括影響細胞周期、糖代謝、蛋白質合成以及維持基因組的穩定性。由于其在癌癥細胞中最常見且作用關鍵,PI3K/Akt信號通路經常被作為癌癥、炎癥和其他疾病的治療靶點[42-44]。相關研究證明,在骨肉瘤的發生和發展過程中PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路經常被激活,激活后的信號通路發揮相關調節作用,影響腫瘤細胞的增殖、侵襲、自噬和凋亡[45]。

楊志強等[46]探究紫草素(shikonin, SK)對骨肉瘤的影響,發現不同濃度的SK對人骨肉瘤U2OS和MG-63細胞都有顯著的毒性作用,導致骨肉瘤細胞的存活率明顯下降,且表現出濃度和時間依賴性。在SK高濃度組,腫瘤細胞中Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值均顯著上調,PI3K和Akt蛋白磷酸化水平顯著降低,而PI3K激活劑血清胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)-1能夠顯著逆轉上述指標的變化,表明紫草素可能通過抑制PI3K/Akt信號通路途徑抑制U2OS細胞的生長并誘導細胞凋亡。杜兵強等[47]用不同劑量的槲寄生溶液處理人骨肉瘤U20S細胞,結果顯示高劑量槲皮素組中PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白的相對表達量以及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B, p-Akt)/Akt表達水平最低,提示槲寄生素可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路相關基因和蛋白的表達來抑制細胞增殖和侵襲能力、促進細胞凋亡, 從而發揮抗腫瘤作用。Liu等[48]研究人參皂苷(ginseng saponin,GS)Rg5對人骨肉瘤細胞增殖以及凋亡的影響,發現GS-Rg5能夠降低PI3K、Akt和mTORC1的磷酸化水平,同時提高微管相關蛋白1輕鏈3(microtubuleassociated protein1 light chain 3,LC3)-Ⅱ/LC3-I 水平,有效抑制人骨肉瘤細胞的增殖,且該作用呈劑量依賴關系,進一步實驗結果表明,PI3K/Akt通路刺激因子IGF-1能夠逆轉GS-Rg5對MG-63細胞自噬的誘導作用,證實GS-Rg5通過自噬相關蛋白LC3介導的自噬途徑誘導人骨肉瘤細胞凋亡。

5 MAPK信號通路

MAPK信號通路是一組能夠被細胞外刺激物激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,包括p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases, p38 MAPK)、細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、ERK 5和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)等4個亞族,能夠影響細胞的增殖、凋亡、分化和生存等活動[49-51]。MAPK信號通路在癌癥的發生和發展中有著十分重要的作用,阻斷或抑制MAPK信號通路已經成為腫瘤治療的新方向[52-53]。相關研究顯示,JNK和p38作為MAPK通路的主要組成部分,與細胞凋亡過程密切相關,可以通過激活JNK、p38通路活性誘導骨肉瘤細胞發生凋亡[54-55]。

黃乾等[56]探究鷹嘴豆芽素A (biochanin-A, BA)對人成骨肉瘤MG-63細胞凋亡的作用機制,發現BA能夠抑制腫瘤細胞的活性,通過上調磷酸化(phosphorylation,p)-p38,p-JNK和p-ERK1/2的表達水平,下調Bcl-2和上調Bax的表達來誘導骨肉瘤細胞的凋亡,而與凋亡相關的蛋白cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶降解產物cleaved-(poly ADP-ribose polymerase,PARP)都隨著BA濃度的上升而增加,提示骨肉瘤細胞的凋亡可能與激活MAPK信號通路有關。張露露[57]探究小豆蔻明(cardamonin,CAR)對人骨肉瘤細胞株143B和MG-63細胞的抑制作用及相關機制,發現CAR可抑制骨肉瘤細胞增殖相關蛋白的表達,并且下調與腫瘤細胞遷移和侵襲相關蛋白的表達水平,上調促凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子(Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter,BAD)、Bax的表達,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的水平,說明CAR能夠抑制骨肉瘤細胞的增殖,阻止其遷移和侵襲,并促進腫瘤細胞凋亡,當加入p38及JNK通路抑制劑后,可部分逆轉CAR對腫瘤細胞的抑制作用,說明CAR抑制骨肉瘤細胞增殖并促進其凋亡的機制與激活MAPK信號通路有關。林淼雄等[58]的研究發現雷公藤內酯醇(triptolide,TPL)能顯著抑制LPS誘導的骨肉瘤MG-63細胞中TNF-α、IL-6、缺氧誘導因子-1α、血管內皮生長因子的表達水平,TPL能夠下調p-p38蛋白的表達量,提示TPL抗LPS誘導的促血管生成和抗炎作用可能與下調p38 MAPK信號通路的活性有關, 表明p38 MAPK可能是TPL作用的靶點。

6 JAK/STAT信號通路

JAK/STAT信號通路由JAKs家族和STATs家族組成[59]。JAKs家族擁有JAK1、2、3和Tyk2共4種激酶,除JAK3之外,其余蛋白都在組織細胞中廣泛存在。STATs家族是JAKs的靶蛋白,共有7種類型的蛋白,分別是STAT1、2、3、4,STAT5a、5b和STAT6。在與之相關的細胞活動中,被磷酸化激活的JAKs家族蛋白進一步與STATs家族蛋白相結合,將集合在該位點的 STAT蛋白激活,活化的STAT蛋白與其受體形成二聚體進入到細胞核,啟動對應的基因轉錄,從而調控下游靶基因的轉錄和表達[60]。JAK/STAT信號通路是重要的細胞因子信號傳導途徑,大量研究證明,骨肉瘤的進展與JAK/STAT 信號傳導失調有關[61-62],其在腫瘤細胞中高度活化,能夠將細胞膜感受到的刺激信號向細胞核傳遞[63],廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程,抑制JAK/STAT信號通路的活性能夠抑制腫瘤細胞的周期進程以及誘導細胞凋亡等過程從而抑制腫瘤細胞的增殖。

宋奇等[64]研究不同濃度的山竹醇抗骨肉瘤U2OS細胞的作用機制,發現隨著藥物作用時間和濃度的增加,腫瘤細胞的活力逐漸降低,大多數細胞周期停滯于S期。檢測結果表明山竹醇能使U2OS細胞中p-JAK2、p-STAT3、B細胞淋巴瘤(B cell leukemia iymphoma,Bcl)-xl等蛋白的表達水平下調,Bax蛋白的表達水平上調,且呈現濃度依賴性,從而有效促進細胞發生凋亡,證明山竹醇抗腫瘤機制可能與抑制JAK/STAT信號通路的活性有關。Lu等[65]的研究表明,姜黃素類似物可有效抑制人骨肉瘤U2OS細胞和MG-63細胞的運動、遷移和侵襲,能夠降低腫瘤細胞中STAT3、JAK1、JAK2 和 JAK3 等蛋白的磷酸化,但不影響ERK、JNK、p38 和 Akt 等的磷酸化,當應用STAT3激活劑后,由姜黃素類似物誘導的尿激酶纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)的降低以及遷移侵襲潛力的下降可以被抵消,表明姜黃素類似物可以通過抑制uPA表達和JAK/STAT 信號傳導來發揮抗骨肉瘤細胞遷移和侵襲的作用。吳倩等[66]探究二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)對人骨肉瘤細胞株MG-63的影響,發現DMY可呈時間和濃度依賴性地抑制細胞生長,阻止細胞的侵襲和遷移,上調促凋亡蛋白Bax、Bak的表達,減少抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,從而誘導細胞凋亡,JAK2、STAT3的磷酸化水平降低說明DMY可通過調控JAK2/STAT3信號通路抑制腫瘤細胞的增殖,誘導細胞凋亡。

7 結語

骨肉瘤作為臨床常見的原發性骨惡性腫瘤,具有較高的肺轉移率和病死率,嚴重危害患者的生存質量,但其發病機制尚不明確,故現有的治療方式并未取得理想的治療效果。在現今的腫瘤防治領域,中醫藥以其多生物活性成分、多靶點、多通路協同作用的治療優勢被社會各界廣泛關注,其通過對腫瘤細胞中的多條信號通路進行有效調控從而發揮抗腫瘤的作用,在抑制骨肉瘤細胞增殖、促進骨肉瘤細胞凋亡、誘導骨肉瘤細胞自噬和抑制血管化進程等方面具有良好的效果,并對減輕家庭、社會負擔和提高患者的生存質量具有較大的意義。因此,基于信號通路探究中醫藥治療骨肉瘤擁有廣闊的發展前景。

但是,現有的研究主要停留在中藥單體及其提取物治療骨肉瘤的基礎實驗研究階段,多為藥物作用于體外骨肉瘤細胞系的研究,未在實際的臨床應用中考量其治療效果,并且忽略了中醫辨證論治的特點以及組方中藥和方劑配伍的治療優勢。因此,今后的研究應重點關注中醫藥應用于骨肉瘤患者的臨床治療效果,并且基于中醫辨證論治理論以及從方藥配伍角度探討中醫藥對骨肉瘤進行靶向治療的可能性,以期為中醫藥更好地應用于腫瘤疾病的防治提供新的治療思路。