膠體金免疫層析技術(shù)在豬病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

馬樹(shù)芳

（山東省濱州市濱城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，山東 濱州 256600）

1971 年Faulk 和Taytor 等首次報(bào)道了膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)，早期主要應(yīng)用于人絨毛膜促性腺素檢測(cè)，后擴(kuò)展到病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域，包括抗原和抗體檢測(cè)兩種類型。膠體金免疫層析試紙條用在豬病抗體和抗原檢測(cè)時(shí)很有優(yōu)勢(shì)，不需要儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，最快10 min 左右即可獲得結(jié)果，價(jià)格便宜，基層獸醫(yī)人員容易掌握，具有良好的應(yīng)用前景和巨大的發(fā)展?jié)摿Α１疚木C述了膠體金技術(shù)原理及在豬病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用，一起為豬病毒病的診斷提供參考。

1 技術(shù)原理

氯金酸在鞣酸、抗壞血酸、白磷等還原劑作用下，形成大小一定的金顆粒，呈穩(wěn)定的膠體狀，帶有負(fù)電荷，故稱為膠體金。膠體金可以跟帶正電荷的抗原或抗體分子穩(wěn)定結(jié)合，而不影響其生物學(xué)特性，可與固定于硝酸纖維素膜上的抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，膠體金顆粒電子具有較高的密度，大量聚集時(shí)，形成肉眼可見(jiàn)的粉紅色條帶，因此，膠體金成為理想的免疫反應(yīng)示蹤標(biāo)記物。

制備快速檢測(cè)試劑主要操作步驟為，首先在玻璃纖維結(jié)合釋放墊上加入金標(biāo)記物，固定，干燥，一端與樣品墊相連，另一端與硝酸纖維素膜相連，膜上加入特異性抗體或抗原，固定后作為檢測(cè)線或質(zhì)控線，硝酸纖維素膜另一端為吸水紙。待測(cè)樣品加入樣品墊后，通過(guò)毛細(xì)管擴(kuò)散或虹吸作用緩慢向前涌動(dòng)，通過(guò)膠體金標(biāo)記物位置時(shí)，水化標(biāo)記物，樣品中如含有待測(cè)物，則與其發(fā)生反應(yīng)，后繼續(xù)向前泳動(dòng)，再與檢測(cè)線上的抗體（或抗原）發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，復(fù)合物被檢測(cè)線捕獲，出現(xiàn)紅色條帶，否則檢測(cè)線位置無(wú)條帶，無(wú)論檢測(cè)線是否有條帶，質(zhì)控線都會(huì)出現(xiàn)紅色條帶，因結(jié)合墊上添加有可與質(zhì)控線處物質(zhì)反應(yīng)的金標(biāo)記物，假如質(zhì)控線無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，則檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，反應(yīng)示意圖如圖1 所示。

圖1 膠體金免疫層析技術(shù)示意圖

2 在豬病毒病檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 豬瘟

豬瘟是一種烈性傳染病，豬是唯一宿主，由豬瘟病毒（CSFV）引起，危害嚴(yán)重，一旦發(fā)病會(huì)給豬場(chǎng)造成毀滅性的打擊。張長(zhǎng)弓等研制了檢測(cè)CSFV 的膠體金免疫層析試紙條，檢測(cè)CSFV 脾淋源及細(xì)胞源疫苗毒結(jié)果均為陽(yáng)性，而對(duì)豬其它常見(jiàn)病原檢測(cè)結(jié)果顯示均陰性。李華瑋等分別以原核表達(dá)的CSFV 弱毒E2 蛋白和CSFV 強(qiáng)毒株細(xì)胞毒作為抗原，利用膠體金標(biāo)記技術(shù)研制了一種能檢測(cè)抗體的膠體金免疫層析試紙條，可用于區(qū)分檢測(cè)CSFV強(qiáng)、弱毒抗體。結(jié)果表明，檢測(cè)時(shí)只需將80 μL 待檢測(cè)豬血清加于加樣端，20 min 后觀察結(jié)果即可。觀察區(qū)若只在上端顯示1 條紅色條帶，則判為CSFV 抗體陰性，若觀察區(qū)上端及中間位置分別出現(xiàn)1 條紅色條帶，則判為CSFV 弱毒抗體陽(yáng)性，若觀察區(qū)上端和下端部位分別出現(xiàn)1 條紅色條帶，則判為CSFV 強(qiáng)毒抗體陽(yáng)性，若上端、中間及下端位置同時(shí)出現(xiàn)3 條紅色帶，則CSFV強(qiáng)抗體和弱毒抗體都是陽(yáng)性。

2.2 豬藍(lán)耳病

由豬藍(lán)耳病（PRRSV）引起的豬藍(lán)耳病重點(diǎn)危害哺乳仔豬和母豬，哺乳仔豬通常臨床表現(xiàn)為呼吸道癥狀，母豬則表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙性疾病。胡冉冉等原核表達(dá)截短的PRRSV M 基因，蛋白純化后，標(biāo)記于檢測(cè)線，SPA 作為金標(biāo)抗原，雞抗SPA 標(biāo)記于質(zhì)控線。結(jié)果顯示，該試紙條與PRV、TGEV、CSFV、PEDV 以PCV2 均不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性好，最低檢測(cè)限度為1 ∶6 400，靈敏性高，批間批內(nèi)無(wú)差異性，4℃可保存30 d，穩(wěn)定性好，臨床樣品檢測(cè)結(jié)果與愛(ài)德士試劑盒符合率高達(dá)94.82%。

2.3 豬偽狂犬病

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒（PRV）引起，是豬場(chǎng)常見(jiàn)的一種疾病，臨床可表現(xiàn)為仔豬腹瀉及神經(jīng)癥狀，母豬則出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙性疾病。雷有玲等采用金標(biāo)SPA 蛋白作為金標(biāo)墊，檢測(cè)線和質(zhì)控線分別標(biāo)記PRV gE 重組蛋白和豬Ig G，組裝膠體金免疫層析試紙，可用于PRV gE 抗體檢測(cè)。15 min內(nèi)觀察結(jié)果，可用于檢測(cè)PRV 野毒陽(yáng)性血清，對(duì)豬常見(jiàn)病毒陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，檢測(cè)靈敏度達(dá)1 ∶1 280，與商品化抗體檢測(cè)試劑盒符合率高達(dá)95.31%，室溫條件下穩(wěn)定保存6 個(gè)月以上。

2.4 豬圓環(huán)病毒病

由豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）引起的豬圓環(huán)病毒病是一種豬場(chǎng)最重要疾病之一，廣泛存在于豬場(chǎng)中，可危害各階段豬。張禹等分別以人工表達(dá)并純化的PCV2 病毒樣顆粒和兔Ig G 作為檢測(cè)線與質(zhì)控線，金標(biāo)墊則利用G 蛋白標(biāo)記的膠體金顆粒制備，組裝膠體金試紙條。結(jié)果表明，試紙條僅與PCV2 抗體陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，不與豬細(xì)小病毒、A 型塞內(nèi)卡病毒、PRV 等抗體陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，最低檢測(cè)限為1 ∶6 400稀釋度，敏感性高，重復(fù)性較好。

2.5 非洲豬瘟

非洲豬瘟是豬的一種高度接觸性、烈性傳染病，由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起，豬只感染后死亡率高達(dá)100%，全身各組織器官?gòu)V泛出血。戴建華等選取ASFV p54 基因的成熟肽序列，分別采用pET30a載體表達(dá)了有終止子（p54）和無(wú)終止子（p54-his）的基因，重組蛋白純化后，分別免疫ASFV 抗體陰性豬，制備相應(yīng)多抗，4 次免疫后，用p54-his 或p54 檢測(cè)多抗效價(jià)，純化p54 抗原，用金顆粒標(biāo)記后作金標(biāo)墊，p54 多抗作質(zhì)控線、SPA 作檢測(cè)線，不斷優(yōu)化反應(yīng)條件，制備ASFV 抗體膠體金免疫層析試紙，最終用p54-his 的多克隆抗體檢驗(yàn)試紙條的可行性。結(jié)果顯示，p54 和p54-his 可溶性表達(dá)產(chǎn)物免疫豬后可產(chǎn)生特異性抗體，效價(jià)達(dá)10-6，以0.3 mg/mL p54 抗原作金標(biāo)墊、1 mg/mL SPA 為捕捉抗原、0.5 mg/mL p54 多抗體作質(zhì)控線，制備試紙條，能有效檢出p54-his 抗體陽(yáng)性血清。

2.6 豬乙型

主要由蚊蟲(chóng)傳播的乙型腦炎是一種人獸共患病，其病毒為乙型腦炎病毒（JEV），主要危害種豬，導(dǎo)致公豬睪丸炎、母豬流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙性疾病。田純見(jiàn)等采用蔗糖密度梯度超速離心濃縮純化JEV 細(xì)胞毒滅活抗原，進(jìn)行膠體金點(diǎn)樣和配比優(yōu)化，制備膠體金層析檢測(cè)試紙條。試紙條能明顯區(qū)別乙型腦炎陰、陽(yáng)性血清，檢測(cè)靈敏度為1 ∶1 024 稀釋的乙型腦炎陽(yáng)性血清。與PRRS、CSF、PCV2D 陽(yáng)性血清不發(fā)生反應(yīng)。

2.7 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉是主要危害哺乳仔豬的疾病，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉，7 日齡內(nèi)仔豬死亡率高，其病原為豬流行性腹瀉病毒（PEDV）。賈宇旻等用PEDV 免疫小鼠，篩選出5 株能針對(duì)PEDV的單抗，選取其中兩株即4H7 和5A9 作為俘獲抗體，建立了檢測(cè)PEDV 的膠體金層析技術(shù)，試紙條具有良好的特異性，僅能檢測(cè)PEDV，對(duì)豬常見(jiàn)病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，最低檢測(cè)PEDV 的含量為7.8×103TCID50/mL 的，敏感性較高，批內(nèi)和批間重復(fù)性良好，與RT-PCR 陽(yáng)性符合率為93%。

2.8 豬傳染性胃腸炎

由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的豬傳染性胃腸炎，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉，通過(guò)糞口途徑傳播，幼齡仔豬受到的危害嚴(yán)重，大日齡豬耐過(guò)后，腸道損傷修復(fù)慢，營(yíng)養(yǎng)吸收不良，生長(zhǎng)速度慢。常亮等在玻璃纖維膜上包被金標(biāo)TGEV 單抗，分別在硝酸纖維膜上不同位置包被純化的羊抗小鼠抗體和TGEV 單克隆抗體，成功研制TGEV 檢測(cè)試紙條，并進(jìn)行靈敏性、特異性測(cè)定。結(jié)果表明，試紙條檢測(cè)TGEV 最低量為150 μg/mL，不與CSFV、PRRSV、鴿新城疫病毒、雞減蛋綜合癥病毒、沙門(mén)氏菌及大腸桿菌產(chǎn)生反應(yīng)。

2.9 豬德?tīng)査跔畈《静?/h3>

由豬德?tīng)査跔畈《? PDCoV)引起的豬德?tīng)査跔畈《静∈秦i場(chǎng)常見(jiàn)的一種疾病，主要引起仔豬水樣腹瀉、嘔吐，幼齡仔豬死亡率高。張敏等原核表達(dá)PDCoV N 蛋白，純化后免疫BALB/c 小鼠，制備2 株單克隆抗體E8 和A10。分別以兔抗鼠作為質(zhì)控線抗體，E8 和A10 作為檢測(cè)線抗體、制備膠體金層析試紙條，該試紙條檢測(cè)PDCoV敏感性為100 TCID50，對(duì)PEDV、TGEV、CSFV、PCV2 等豬常見(jiàn)病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.10 豬輪狀病毒病

豬輪狀病毒（PoRV）可引起豬輪狀病毒病，該病流行范圍廣，PoRV 血清型眾多，臨床表現(xiàn)主要為嘔吐、水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水，可造成幼齡豬大量死亡。劉兆磊等將抗豬PoRVVP6 蛋白單抗用膠體金顆粒標(biāo)記后，固定于結(jié)合墊上，硝酸纖維素膜不同位置分別噴加純化后的抗PoRV VP6 蛋白多抗和羊抗鼠IgG，制成膠體金層析檢測(cè)試紙條，用于PoRV 抗原檢測(cè)。結(jié)果表明，該試紙條檢測(cè)細(xì)胞毒PoRV時(shí)，檢測(cè)線處有1 條紅色條帶，檢測(cè)敏感性高，試紙條的最低可檢測(cè)1 ∶32 稀釋TCID50為10-6.25/0.1 mL的PoRV 細(xì)胞毒，特異性好，不與TGEV、PEDV 發(fā)生反應(yīng)，且具有良好重復(fù)性，各批次試紙條之間無(wú)明顯差別。

3 小結(jié)

隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬場(chǎng)疾病復(fù)雜，癥狀不典型，混合感染常發(fā)生，僅憑癥狀很難鑒別，需要借助科學(xué)的檢測(cè)方法。疾病的快速檢測(cè)是科學(xué)防控的前提和基礎(chǔ)。常用豬病確診方法有兩種，PCR 方法檢測(cè)病原核酸和ELISA 方法檢測(cè)血清中抗體，兩種方法存在一些弊端，如對(duì)儀器、設(shè)備有一定的需求，操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，需要經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)的技術(shù)人員，很難在基層大規(guī)模推廣應(yīng)用。

以膠體金作為示蹤標(biāo)記物在豬病檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，與PCR、ELISA 等疾病檢測(cè)技術(shù)相比，應(yīng)用于豬病毒病抗原或抗體的診斷領(lǐng)域，具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，如不需要額外配備PCR 儀或紫外分光光度計(jì)等設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，對(duì)人員要求低，且試紙條體積小，可常溫保存運(yùn)輸，操作便捷，檢測(cè)速度度快，不需要其他試劑，安全無(wú)污染，可直接肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，一次可篩查大量樣本。膠體金技術(shù)用于豬病檢測(cè)也存在一些缺點(diǎn)和不足，如檢測(cè)敏感性低，容易漏檢，適合普篩，不能滿足高標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)需求，檢測(cè)復(fù)雜樣本時(shí)，容易受到干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此，相對(duì)準(zhǔn)確性偏低，不能實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，對(duì)多種疾病混感病例篩查受限，只能定性檢測(cè)，無(wú)法對(duì)待檢品定量檢測(cè)，且不適用于組織樣品中病原的檢測(cè)。總體而言，膠體金免疫層析技術(shù)的大規(guī)模推廣應(yīng)用可提高基層及偏遠(yuǎn)落后地區(qū)疾病檢測(cè)準(zhǔn)確度，在臨床一線應(yīng)用效果好，可替代性差，對(duì)我國(guó)動(dòng)物檢疫的快捷化具有重大促進(jìn)意義。