外周血宏基因組二代測序在肺炎中的應用價值

王東輝 俞小衛 許婷 楊明夏 王曉華

在肺炎的診斷和治療過程中,及時有效的確定致病菌意義重大,然而常規微生物檢測(conventional microbiology testing ,CMT)方法發現病原體的比例不足40%[1]。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)作為一種新興的檢測技術,敏感度高,時效性快,越來越多的應用于感染性疾病的診斷和治療。mNGS檢測的標本不受限制,痰液、血液、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、腦脊液甚至組織都可以進行病原學方面的檢測。已經有不少研究發現,肺炎患者中BALF mNGS在病原學檢出方面要優于CMT[2-5],但是國內外鮮有研究專門評估血mNGS在肺炎患者中的應用價值。因此本文旨在初步探索外周血mNGS技術在肺炎患者中微生物檢測方面的應用價值。

資料與方法

一、研究對象

經我院倫理委員會批準(KY323-01),回顧性分析了2019年8月至2021年10月在常州市第二人民醫院住院并進行mNGS檢測的肺炎患者。納入標準:(1)年齡≥18歲。(2)社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)以及重癥肺炎的診斷標準符合2016年版CAP診斷和治療指南[6]。(3)同時進行CMT和mNGS檢測。排除標準:(1)mNGS檢測的標本不是血液。(2)未使用華大醫學的mNGS技術進行檢測。

二、研究方法

收集入選患者的一般資料,包括性別、年齡、合并癥、影像學資料和診斷。CMT方法包括:痰培養、血培養、BALF培養、軍團菌抗體檢測、肺炎鏈球菌抗原檢測、支原體/衣原體抗體檢測、1,3-β-D-葡聚糖試驗(G試驗)、血清半乳甘露聚糖抗原試驗(GM試驗)、病毒核酸檢測、病毒抗原抗體檢測等。檢測結果根據2016年版CAP診斷和治療指南進行判讀[6]。

mNGS檢測:從外周靜脈采取3～5mL血液,在6℃～35℃環境中儲存和運輸。使用華大醫學的PMseq?病原微生物高通量基因檢測技術進行檢測。將檢測出的病原微生物與空白對照、華大基因環境微生物數據庫進行對比,刪除可疑的背景微生物。

綜合分析患者的病史、影像學資料、CMT以及mNGS檢測結果來判斷肺炎的致病菌,并以此為金標準。

三、統計學分析

使用SPSS 25.0軟件進行統計學分析和GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖。計數資料采用n(%)表示,計量資料采用中位數(M)和四分位間距(IQR)表示。采用McNemar檢驗用于兩配對樣本的統計檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、患者一般情況

回顧性的分析了2019年8月至2021年10月在常州市第二人民醫院住院并進行mNGS檢測的患者。經過篩選,在排除非肺炎患者以及使用其他體液標本(痰、BALF、腦脊液等)進行檢測的患者后,最終有28例患者納入了研究。在這28例患者中,男性13例(46.4%),女性15例(53.6%),中位年齡69(55,79)歲。重型肺炎19例(67.9%),非重型肺炎9例(32.1%)。心腦血管疾病(39.3%)是最常見的合并癥,后續依次是惡性腫瘤(28.6%)、肝腎疾病(21.4%)、糖尿病(17.9%)和慢性呼吸疾病(7%)(表1)。

表1 患者的臨床特征[n(%)/M(P25,P75)]

二、肺炎患者血mNGS和CMT檢測結果比較

28例患者中,mNGS的微生物陽性率為78.6%(22/28),8例(28.6%)檢測出細菌,7例(25%)檢測出真菌,16例(57.1%)檢測出病毒,2例(7%)檢出鸚鵡熱衣原體。CMT的微生物陽性率為64.3%(18/28),6例(21.4%)檢測出細菌,14例(50%)檢測出真菌,其中6例僅有G試驗試驗或GM試驗陽性,無法區分特定真菌。3例(10.7%)檢測出病毒。兩種方法相比較,微生物檢出率差異無統計學意義(P=0.338),但是mNGS在病毒檢出方面要優于CMT(P=0.004),而在細菌(P=0.625)和真菌(P=0.118)方面無明顯優勢(圖1A)。兩種方法檢測到的具體病原學類型(見表2)。

圖1 A:所有納入的肺炎患者中血mNGS和CMT在病原學檢出方面的比較;B:重癥肺炎患者中血mNGS和CMT在病原學檢出方面的比較

表2 所有納入的患者中兩種方法檢測到的病原學種類[n(%)]

三、重癥肺炎患者血mNGS和CMT檢測結果比較

19例重癥肺炎患者納入了研究。mNGS的微生物陽性率為78.9%(15/19),6例(31.6%)檢測出細菌,6例(31.6%)檢測出真菌,12例(63.2%)檢測出病毒,1例(5%)檢測出鸚鵡熱衣原體。CMT的微生物陽性率為68.4%(13/19),4例(21.1%)檢測出細菌,11例(57.9%)檢測出真菌,其中4例僅有G試驗或GM試驗陽性,無法區分特定真菌。3例(15.8%)檢測出病毒。同樣,二者病原體檢出率差異無統計學意義(P=0.687)。mNGS對病毒的檢出依舊優于CMT(P=0.035),而對細菌(P=0.5)和真菌(P=0.508)的檢出仍無優勢(圖1B)。兩種方法檢測到的具體病原學類型(見表3)。

表3 重癥肺炎患者中兩種方法檢測到的病原學種類[n(%)]

四、血mNGS確診的致病菌

綜合分析患者的病史、影像學資料、CMT以及mNGS檢測結果來判定致病菌。7例患者的致病菌依賴mNGS確診,其中6例重癥肺炎,1例非重癥肺炎。確診的致病菌中,耶氏肺孢子菌(pneumocystis jirovecii,PJ)2例,PJ合并巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)2例,鸚鵡熱衣原體2例,腺病毒1例(表4)。

表4 血mNGS確診的致病菌類型

討 論

盡管血液一直被認為是無菌環境,但是國外一項研究表明健康人體的血液中也會有細菌存在[7]。Langelier等[8]更是使用mNGS技術發現,重癥肺炎患者的血液中能夠檢測到呼吸道標本中的細菌DNA。這意味著呼吸道病原體DNA釋放入血要比想象中的更普遍,而且能夠使用mNGS技術進行檢測。但是在肺炎患者中比較血mNGS和CMT在病原學診斷方面的研究很少,其中Farnaes等[9]在15例兒童肺炎患者中進行了研究。這些患兒平均年齡4.16歲,其中10例合并有胸腔積液或膿胸,9例因為病情需要在監護室中進行治療。86%的患兒可以通過血mNGS檢測到病原體,而CMT只有47%。但是我們的研究發現血mNGS和CMT的病原學陽性率(78.6%vs64.3%,P=0.338)無顯著差別,即使在重癥肺炎亞組中,兩者仍無統計學差異(78.9%vs68.4%,P=0.687)。

本研究發現,mNGS在對病毒的檢出優于CMT,最常檢出的病毒類型為細環病毒、EB病毒、CMV。由于細環病毒和EB病毒在人群中廣泛存在[10-11],且檢測到的序列數較少,未被認定為致病的病原體。而2例CMV和1例腺病毒有著較高的序列數(分別為291、464、1239),同時結合影像學表現,被認為是導致肺炎的病原體。病毒是肺炎一大常見病原體,國內研究發現肺炎患者中病毒檢出率為15%～34.9%[6],國外的系統性綜述發現該比例為22%～24.5%[12-13]。用于病毒檢測的CMT主要是呼吸道拭子核酸和血清抗體,但是這些方法僅能針對特定的病毒,存在可檢測種類少、無法檢測未知病毒等缺點,難以滿足臨床需求。而mNGS不僅可以檢測出常見病毒,在診斷新發病毒和罕見病毒方面具有獨特優勢,比如2019年底爆發的新型冠狀病毒。但是對于一些常見病毒,由于在體內普遍存在,如果檢測出的序列數較少,則無明確的臨床意義。

本研究發現,mNGS和CMT在真菌檢出方面無顯著差異,但CMT以念珠菌檢出為主,而mNGS以PJ檢出為主。國內國外有研究使用實時熒光定量PCR方法對呼吸道標本進行檢測后發現,PJ在免疫健全人體中的定植比例為14.29%～20%[14-15],這意味著BALF中檢出的PJ未必是致病菌。對于健康人體的血中是否存在PJ尚不清楚,但在感染者的外周血中卻可以輕易檢測到。顧鵬等[16]對37例臨床診斷為肺孢子菌肺炎的患者進行研究后發現,血mNGS的敏感度為94.59%,特異度為100%。這意味著如果臨床懷疑PJP,可以采用外周血進行mNGS檢測,而不必使用BALF。同時使用mNGS技術還發現54.3%的患者合并有CMV感染。這與我們的研究結果相似,在4例明確為PJ感染者中,2例檢出較高序列數的CMV。PJP和CMV肺炎都常見于免疫抑制患者,且二者在影像學上的表現相似,臨床上鑒別困難,而使用mNGS技術有助于二者的診斷。我們的研究中還有2例通過血mNGS診斷為鸚鵡熱衣原體肺炎。鸚鵡熱衣原體使用CMT診斷缺點明顯,且大部分三甲醫院都不具備條件。通過對已經發表的文獻分析后發現,mNGS技術已經成為鸚鵡熱衣原體肺炎主要的確診手段[17-19]。

BALF是肺炎患者最佳的檢測標本。有研究表明,BAFL mNGS在檢測細菌和真菌方面的敏感度要高于血mNGS,不過在某些病毒方面如CMV、EB病毒,血mNGS略占優勢[20]。但是臨床上總有一些不適宜或不愿意進行氣管鏡檢查的患者。比如部分PJ感染的患者在入院時已經出現了明顯的呼吸衰竭并進行了無創機械通氣,無法耐受氣管鏡檢查,血液可作為退而求其次的mNGS檢測標本。而且有研究表明,血液mNGS對PJ的檢出率不劣于BALF mNGS,但是檢出的PJ序列數要顯著低于BALF[21]。此外,對于已經出現膿毒癥休克的肺炎患者,也可以考慮使用血液進行NGS檢測。國內外均有研究表明,使用血mNGS檢測技術能夠提高膿毒癥患者中病原體的診斷率[22-26]。膿毒癥休克是診斷重癥肺炎的主要標準之一,本研究中通過血mNGS確診病原體的7例患者中,6例是重癥肺炎。盡管mNGS技術在感染性疾病的病原學診斷方面展現出巨大潛能,但仍需客觀看待其檢測結果。不論是CMT還是mNGS,都僅是為我們提供診斷線索,不作為診斷的金標準。最終確診需要結合患者臨床特點、實驗室指標以及影像學表現等綜合分析。

本研究存在一些局限性:1.本文納入的病例數偏少。考慮到不同檢測公司的技術差異,我們選擇了業內最早進行NGS檢測的一家公司的檢測結果用以研究。另外由于我們研究所使用的標本是外周血,但臨床上更多的肺炎患者是使用BAFL進行mNGS檢測。兩個因素共同導致了研究樣本量較少。2.本研究中的患者在進行血mNGS檢測時已經進行了相應的抗感染治療,這可能會減少外周血中的病原體數量,從而降低mNGS對病原菌檢測的敏感性。3.雖然我們探討了血mNGS結果對病原學診斷的影響,但是未進一步深入研究mNGS結果對病人住院時間、抗生素使用、機械通氣時間以及死亡率等臨床結局的影響。這些結局顯然有著更重大的臨床意義,因此未來仍需要更大的樣本量以及更充實的數據來進行此方面的研究。

綜上,盡管很多研究表明肺炎患者中BALF mNGS在病原學診斷方面優于CMT,但本研究提示血mNGS與CMT相比無明顯優勢。不過當懷疑患者存在病毒、PJ、鸚鵡熱衣原體感染,而又無法獲取BALF時,可以考慮使用血mNGS進行病原學檢測。