老年護(hù)理醫(yī)院長(zhǎng)期住院患者腸道耐碳青霉烯類腸桿菌攜帶分析

李奇,薛堅(jiān),張泓

1. 上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200062; 2. 上海市金山區(qū)眾仁老年護(hù)理醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 201501

耐碳青霉烯腸桿菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae, CRE)是臨床上常見(jiàn)的多重耐藥菌,在醫(yī)院環(huán)境中可以通過(guò)人物間或人際間的直接接觸發(fā)生播散或轉(zhuǎn)移定植[1]。攜帶CRE的患者可能成為醫(yī)院內(nèi)CRE的傳播來(lái)源,盡早發(fā)現(xiàn)CRE有助于更好地預(yù)防和控制,因此2015年以來(lái)國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)指南建議對(duì)易感染CRE的高風(fēng)險(xiǎn)人群開(kāi)展CRE定植的主動(dòng)篩查,并建議將腸道標(biāo)本作為篩查的優(yōu)選標(biāo)本[2]。老年護(hù)理醫(yī)院的絕大部分患者具有住院時(shí)間長(zhǎng)、高齡、深度的免疫衰老或伴有多種慢性疾病等臨床特點(diǎn),是易感染CRE的高風(fēng)險(xiǎn)人群[3]。近年來(lái)在綜合性醫(yī)院中對(duì)易發(fā)生CRE感染患者開(kāi)展CRE腸道定植的研究較多,對(duì)老年護(hù)理醫(yī)院住院患者腸道CRE的攜帶情況研究較少。本課題以主動(dòng)篩查的方式對(duì)老年護(hù)理醫(yī)院長(zhǎng)期住院者腸道CRE的攜帶情況進(jìn)行探討,了解CRE腸道攜帶者的比例、臨床特征以及CRE的分子特征,為進(jìn)一步的控制干預(yù)措施提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料于2021年4月依據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)選取上海市金山區(qū)眾仁老年護(hù)理醫(yī)院220位60歲及以上長(zhǎng)期住院者(住院時(shí)間≥90d)作為研究對(duì)象,收集相關(guān)病史資料,其中女性143位,男性77位,平均年齡(84.79±7.57)歲,平均住院時(shí)間為1 100.47 d。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥60歲,住院時(shí)間≥3個(gè)月; (2)能自主排便; (3)入組患者采樣前無(wú)腸道感染癥狀。所有研究均在醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行(倫理批號(hào):202007)。

1.2采集樣本類型和頻率首次采樣在2021年4月2日全部完成,計(jì)劃采集3次,隔1周采集1次,主要采集納入患者的糞便樣本,對(duì)于當(dāng)日無(wú)糞便的患者則采集肛拭子樣本[4]。若患者送檢樣本中檢測(cè)出CRE,則判斷該患者腸道有CRE攜帶,不再進(jìn)行后續(xù)采樣;若患者3次采集的糞便樣本中均未發(fā)現(xiàn)CRE,則判斷該患者腸道無(wú)CRE攜帶。

1.3儀器與試劑全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀為VITEK-2 compact(法國(guó)生物梅里埃公司),鑒定卡為配套的GN卡;藥敏紙片亞胺培南、美羅培南的品牌為OXOID;M-H培養(yǎng)基和CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基購(gòu)自于上海科瑪嘉微生物科技有限公司, APB和EDTA試劑購(gòu)自于珠海迪爾生物工程有限公司,所有試劑均在有效期內(nèi)。陰性質(zhì)控菌株ATCC25922來(lái)源于上海市臨床檢驗(yàn)中心,陽(yáng)性質(zhì)控菌株是經(jīng)基因測(cè)序的KPC-2型肺炎克雷伯菌臨床株。

1.4方法

1.4.1 CRE的篩查 (1)大便標(biāo)本的采集和運(yùn)送 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》要求進(jìn)行。(2)CRE的篩選 將大便樣本接種于CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基,于35 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h。依據(jù)CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基使用說(shuō)明書(shū),將疑似CRE挑出并純化,培養(yǎng)18～24 h后使用接種環(huán)挑取少許菌落置入含有1.5 mL胰大豆腦心浸液的菌株保存管中并混勻,隨后放置在-22 ℃冷凍冰箱種保存。

1.4.2 CRE的鑒定與復(fù)核 菌株的鑒定 將冷凍保存的菌液恢復(fù)至室溫,從中吸取200 μL轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板,培養(yǎng)18～24 h。使用儀器VITEK-2 Compact配套的GN卡進(jìn)行菌種的鑒定。對(duì)鑒定為腸桿菌科的細(xì)菌,采用K-B法測(cè)定該菌對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥性,若對(duì)任意一種藥物表現(xiàn)為耐藥,則認(rèn)為該菌為CRE。體外藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)的判斷依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinicaland laboratory standardInstitute, CLSI)2022年M100文件[5]。

1.4.3 CRE耐碳青霉類藥物表型檢測(cè) 采用碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRE耐碳青霉類藥物表型,具體操作見(jiàn)參照文獻(xiàn)[6]。產(chǎn)A類碳青霉烯酶:含APB的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 m;產(chǎn)B類碳青霉烯酶:含EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm;同時(shí)產(chǎn)A類碳青霉烯酶和B類金屬酶:同時(shí)含APB和EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm;不產(chǎn)A類或B類碳青霉烯酶:含酶抑制劑的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥相差均<5 mm。

1.4.4 產(chǎn)碳青酶烯酶基因檢測(cè) 使用PCR檢測(cè)CRE常見(jiàn)的5種產(chǎn)碳?xì)涿赶┟富?blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48),將分純后的菌株送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)、凝膠電泳和基因測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI上比對(duì)以確定基因型。PCR反應(yīng)體系為25 μL:MIX液12.5 μL、模板2 μL、引物上下游各1 μL、雙蒸水8.5 μL,反應(yīng)條件設(shè)置為94 ℃預(yù)變性5min, 94 ℃變性 60S,退火30 S, 72 ℃延伸60 S,總共循環(huán)數(shù)為35個(gè)(退火溫度和引物序列見(jiàn)下表1)。

表1 5種耐藥基因PCR實(shí)驗(yàn)引物相關(guān)信息

2 結(jié)果

2.1腸道攜帶CRE的篩檢結(jié)果220位患者中腸道CRE攜帶者的所占比為8.18%(18/220)。第1批次送檢的220份糞便樣本中,18份糞便樣本中篩查出CRE;第2批次和第3批次202位無(wú)腸道CRE攜帶者的糞便樣本中均未檢測(cè)出CRE。在菌群分布上以CR-ECO為主,其所占比為50.00%(9/18);其次為CR-KPN,所占比33.33%(6/18),耐碳青霉烯陰溝腸桿菌(CR-ECL)2株,所占比為11.11%,耐碳青霉烯枸櫞酸桿菌(CR-CFR)1株,所占比為5.56%,具體的篩檢結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 腸道攜帶CRE的篩檢結(jié)果

2.2碳青霉烯酶表型及基因檢測(cè)結(jié)果18株CRE均是產(chǎn)碳青霉烯酶CRE(CPE),碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)顯示11株CRE表達(dá)B類酶,所占比61.11%; 7株CRE表達(dá)A類酶,所占比為38.89%。在表達(dá)B類酶的菌株中, 7株為CR-ECO,所占比為63.64%;在表達(dá)A類酶的菌株中, 5株為CR-KPN,所占比為71.43%。分離的CR-KPN以產(chǎn)KPC(83.33%)為主, CR-ECO以產(chǎn)NDM(77.78%)為主。18株CRE中檢測(cè)出2種碳青霉烯酶基因, 11株檢測(cè)出blaNDM,檢出率為61.11%;7株檢測(cè)出blaKPC,檢出率為38.89%,blaVIM、blaOXA-48和blaIMP均未檢測(cè)出。

測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)blaKPC的基因型均為blakpc-2型,而blaNDM有blaNDM-1和blaNDM-5兩種亞型,blaNDM-1有8株,是主要的blaNDM亞型,同時(shí)blaNDM-5有3株,均被CR-ECO攜帶,具體的研究數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1。

(A) 碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)和凝膠電泳結(jié)果 (B)碳青霉烯酶基因測(cè)序結(jié)果

2.3腸道CRE攜帶患者的基礎(chǔ)臨床資料由表3可知,統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)CRE腸道攜帶組與無(wú)攜帶組住院者在年齡、性別、住院時(shí)間、慢性呼吸道疾病、慢性泌尿系統(tǒng)疾病、慢性心臟疾病、慢性胃腸道疾病、糖尿病、高血壓、腦血管意外、長(zhǎng)期臥床、 ICU轉(zhuǎn)入、導(dǎo)尿管使用上的臨床特征均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),只有長(zhǎng)期留置胃管(>30 d)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明長(zhǎng)期使用留置胃管(>30 d)的患者最有可能是CRE腸道攜帶者,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 腸道CRE攜帶患者基礎(chǔ)臨床資料

3 討論

CRE可以在住院患者的胃腸道中存活而不引起任何感染癥狀,據(jù)報(bào)道,糞便CRE攜帶是發(fā)生CRE感染的重要危險(xiǎn)因素,有CRE定植的嚴(yán)重疾病患者其感染CRE風(fēng)險(xiǎn)至少比沒(méi)有CRE定植的患者高兩倍,同時(shí)從感染控制的角度來(lái)看,區(qū)分CRE的耐藥機(jī)制具有重要的感染控制意義[7]。本研究的目的是確定老年護(hù)理醫(yī)院長(zhǎng)期在院患者CRE的腸道攜帶率,闡明腸道攜帶CRE的表型和分子特征,發(fā)現(xiàn)潛在的腸道攜帶CRE的患者臨床特征,為老年護(hù)理醫(yī)院早期防控CRE提供依據(jù)。

西班牙的Aranzábal等[4]對(duì)馬德里社區(qū)3家長(zhǎng)期護(hù)理醫(yī)院開(kāi)展腸道攜帶CRE主動(dòng)篩查時(shí)發(fā)現(xiàn),腸道CRE平均攜帶率為4.1%,在菌群分布上以CR-KPN為主,其次才是CR-ECO。Yamamoto等[8]研究發(fā)現(xiàn)日本大阪北部長(zhǎng)期護(hù)理醫(yī)院住院患者腸道CRE的攜帶率為14.9%,菌群分布以CR-ECO為主,其次是CR-KPN,而比利時(shí)的研究者在1家老年護(hù)理醫(yī)院未發(fā)現(xiàn)腸道攜帶CRE的患者[9]。在本研究中, CRE腸道攜帶者的所占比為8.18%,高于Aranzábal[4]等人的研究結(jié)果,但低于Yamamoto[8]等人研究結(jié)果, CRE的菌群分布與以上文章所報(bào)道的不盡相同,可見(jiàn)腸道攜帶CRE患者的檢出率以及CRE的菌屬分布的差異與患者所在區(qū)域的醫(yī)療環(huán)境有關(guān)。

隨著亟需長(zhǎng)期恢復(fù)治療的老年患者向老年護(hù)理醫(yī)院轉(zhuǎn)移, CRE有從綜合性醫(yī)療機(jī)構(gòu)向老年照護(hù)機(jī)構(gòu)播散的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)日本大阪長(zhǎng)期護(hù)理醫(yī)院住院患者腸道攜帶CRE中95.7%的菌株是攜帶blaIMP的CPE,同時(shí)期當(dāng)?shù)鼐C合性醫(yī)院最流行的碳青霉烯酶是IMP型[8,10]。Aranzábal等[4,11]發(fā)現(xiàn)OXA-48是西班牙馬德里長(zhǎng)期護(hù)理醫(yī)院患者腸道攜帶CPE產(chǎn)生的主要碳青霉烯酶,同時(shí)期該地區(qū)流行的CPE主要攜帶blaOXA-48。本研究中腸道攜帶CR-KPN以產(chǎn)KPC(83.33%)為主, CR-ECO以產(chǎn)NDM(77.78%)為主,與全國(guó)范圍36家綜合性醫(yī)院流行CRE的產(chǎn)碳青霉烯酶分布情況相符[12]。可以發(fā)現(xiàn)不同地域老年護(hù)理醫(yī)院住院患者腸道攜帶CPE表達(dá)的碳青霉烯酶與同區(qū)域流行CPE的產(chǎn)碳青霉烯酶型別相似,可能是攜帶CRE的患者由綜合性醫(yī)院向老年護(hù)理醫(yī)院轉(zhuǎn)移導(dǎo)致這種相似。本次研究發(fā)現(xiàn)老年護(hù)理醫(yī)院腸道攜帶blaNDM的CPE檢出率較高,攜帶blaNDM-5的均是CR-ECO,考慮到blaNDM-5菌株的播散風(fēng)險(xiǎn),臨床上應(yīng)關(guān)注住院患者的腸道CRE的攜帶情況[13]。

外源性因素是醫(yī)院患者獲得CRE的主要原因,及時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶CRE高風(fēng)險(xiǎn)患者,可以指導(dǎo)臨床及時(shí)采取額外的干預(yù)措施限制CRE的播散,但不同類別機(jī)構(gòu)的住院患者腸道攜帶CRE的因素不盡相同。Yamamoto[8]等研究發(fā)現(xiàn)腸道攜帶CRE患者危險(xiǎn)因素是長(zhǎng)期住院時(shí)間、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和抗菌藥物暴露史,其中腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)是最高的危險(xiǎn)因素。也有研究結(jié)果顯示高危科室住院患者中年齡≥60歲、留置胃管是腸道發(fā)現(xiàn)CRE陽(yáng)性的危險(xiǎn)因素[14]。本組研究發(fā)現(xiàn)侵入性操作的長(zhǎng)期使用留置胃管(>30d)的患者最有可能是CRE的腸道攜帶者,與以上老年患者CRE腸道定植的高危因素結(jié)果相符,建議老年護(hù)理醫(yī)院應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期使用留置胃管(>30d)的患者加強(qiáng)CRE的防控措施。防控CRE的措施有多種,對(duì)于老年護(hù)理醫(yī)院等類似的養(yǎng)老機(jī)構(gòu)還應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)生活照護(hù)護(hù)理員的培訓(xùn)與監(jiān)督[15]。

綜上所述,老年護(hù)理醫(yī)院長(zhǎng)期住院者中有較高比例的CRE腸道攜帶者,腸道攜帶CRE的分子特征提示有播散的風(fēng)險(xiǎn),長(zhǎng)期使用留置胃管(>30 d)的住院者最有可能是CRE的腸道攜帶者,因此建議老年護(hù)理醫(yī)院應(yīng)對(duì)剛?cè)朐阂约伴L(zhǎng)期住院者開(kāi)展定期的腸道CRE篩查,臨床上應(yīng)采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施控制應(yīng)對(duì)腸道CRE的攜帶定植。