BTK抑制劑LOXO-305的合成工藝研究

項良華 王 霞 袁 昕 姜虹羽 王 杰 唐春雷

(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

LOXO-305(1)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示,是由Redx Pharma公司開發(fā),后被禮來公司收購的一種處于3期臨床研究階段的口服非共價布魯頓酪氨酸激酶(BTK)抑制劑。BTK是一種非受體蛋白酪氨酸激酶(Tec)家族的細胞質(zhì)激酶,由調(diào)節(jié)不同信號通路(包括PI3K、MAPK和NF-κB等)的造血細胞和漿細胞表達[1, 2]。BTK是B淋巴細胞(B細胞)受體通路的重要信號分子,在B細胞的各個發(fā)育階段表達,B細胞的異常激活被證明在B細胞惡性腫瘤、自身免疫性疾病和炎癥的發(fā)病機制中起核心作用[3]。過去十年已經(jīng)開發(fā)了相當(dāng)數(shù)量的BTK抑制劑,第一代和第二代主要是共價抑制劑(圖2),第三代主要是非共價抑制劑,其開發(fā)處于早期階段。伊布替尼(2)是首創(chuàng)的共價BTK抑制劑,已被批準(zhǔn)用于治療套細胞淋巴瘤和邊緣區(qū)淋巴瘤,目前正在研究用于其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者[4]。然而,伊布替尼的治療相關(guān)不良反應(yīng)(AE)限制了其在癌癥治療中的應(yīng)用,在臨床研究中,一些不良事件導(dǎo)致大量(9～23%)患者停止治療[5-8]。

圖1 LOXO-305Fig. 1 LOXO-305

圖2 目前上市的BTK抑制劑Fig. 2 BTK inhibitors currently on the market

此外,耐藥突變體的產(chǎn)生減少了它們的使用,特別是,用絲氨酸殘基等位替換481號位半胱氨酸(Cys481)降低了不可逆BTK抑制劑的主要活性。然而,不與Cys481相互作用的可逆抑制劑可以抑制C481R、T474I和T474M突變體,這成為一種新的開發(fā)方向。LOXO-305,一種可逆抑制劑,適用于BTK和BTK的不同變體C481突變,具有高靶向效力(IC50<1×10-9mol·L-1),對體外檢測的370種激酶中超過98%表現(xiàn)出大于300倍的選擇性,在1 mmol·L-1時對非激酶脫靶沒有顯著抑制[9]。LOXO-305有望在對伊布替尼產(chǎn)生耐藥性而復(fù)發(fā)的疾病中表現(xiàn)出有效的治療活性。本文對LOXO-305的合成方法進行研究,以期為該化合物及結(jié)構(gòu)類似物的研究提供理論參考。

1 合成路線

目前,只有原研公司報道了LOXO-305的合成路線[10](圖3):以5-氟-2-甲氧基苯甲酸(X1)為起始原料,在氮氣氛圍下以乙腈(ACN)為溶劑,與二氯亞砜(SOCl2)反應(yīng),得到酰氯衍生物X2,然后4-氨甲基苯甲酸與X2偶聯(lián)得到產(chǎn)物X3;產(chǎn)物X3再以同樣的條件制成X4,隨后與丙二腈偶聯(lián)得到中間體X5;中間體X5在92 ℃條件下與原甲酸三甲酯(TMOF)反應(yīng)得到產(chǎn)物X6;產(chǎn)物X6與2,2,2-三氟-1-甲基乙基肼在三乙胺(TEA)的催化下環(huán)合得到環(huán)合產(chǎn)物X7;環(huán)合產(chǎn)物X7再經(jīng)氰基水解得到終產(chǎn)物L(fēng)OXO-305。

圖3 LOXO-305的合成路線Fig. 3 Synthetic route of LOXO-305

原研專利的合成路線步驟為七步反應(yīng),較為煩瑣,增加了工藝成本,另外部分中間體需要經(jīng)過兩次酰氯反應(yīng),容易產(chǎn)生大量毒廢氣體,不利于環(huán)保,限制了該合成路線在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。作者同樣以5-氟-2-甲氧基苯甲酸(X1)為起始原料,經(jīng)兩步縮合反應(yīng)即可得到關(guān)鍵中間體N-((4-(2,2-二氰基-1-羥基乙烯基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X5)(圖4),反應(yīng)條件溫和,避免了使用酰化試劑,且收率高達90.4%,大大降低了工藝成本。另外,4-氨甲基苯甲酸原料在有機溶劑中的溶解度極差,大大延長了反應(yīng)時間,影響收率。改進工藝中選擇氫氧化鈉(NaOH)水溶液作溶劑,能很好地溶解該原料,在室溫下僅3 h就能反應(yīng)完全。優(yōu)化之后的工藝路線不僅提高了總收率,降低了生產(chǎn)成本和能耗,而且反應(yīng)條件相對溫和,后處理操作簡便,適合工業(yè)化制備。

圖4 LOXO-305優(yōu)化的合成路線Fig. 4 Optimized synthetic route of LOXO-305

2 合成實驗

2.1 主要儀器與試劑

LCMS-80質(zhì)譜儀,日本島津公司;LC1260色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;Bruker AVII-400 MHZ核磁共振儀,德國Bruker公司,TMS為內(nèi)標(biāo)。實驗所用試劑均為市售分析純或化學(xué)純,未經(jīng)進一步純化處理。

2.2 合成步驟

2.2.1 4-(((5-氟-2-甲氧基苯甲酰基)氨基)甲基)苯甲酸(X3)的制備

5-氟-2-甲氧基苯甲酸(5g,29 mmol)溶于60 mL四氫呋喃(THF)中,冰浴條件下加入N,N-羰基二咪唑(CDI)(4.7 g,29 mmol)攪拌30 min,將上述反應(yīng)液緩慢滴加至4-氨甲基苯甲酸(4.4 g,29 mmol)的NaOH溶液中(1 mol·L-1),滴畢,移至室溫反應(yīng)3 h。薄層色譜法(TLC)監(jiān)測原料反應(yīng)完畢。用5 mol·L-1HCl調(diào)pH至3～4,溶液變澄清,減壓濃縮至體積20 mL左右,大量固體析出,抽濾,濾餅用乙醇(EtOH)淋洗2次,置于真空干燥箱干燥過夜,得白色固體8.7 g,收率98.2%。ESI-MS m/z: 304.1[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ12.85 (s, 1H), 8.87 (t,J=6.1 Hz, 1H), 7.91 (d,J=8.1 Hz, 2H), 7.50 (dd,J=9.2, 3.3 Hz, 1H), 7.44 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.37～7.31 (m, 1H), 7.19 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 4.56 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H).

2.2.2 N-((4-(2,2-二氰基-1-羥基乙烯基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X5)的制備

在氮氣氛圍,冰浴條件下向1-羥基苯并三唑(HOBT)(3.8 g,29 mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(5.3 g,29 mmol)、X3(8.5 g,28 mmol)和丙二腈(2.2 g,34.8 mmol)的THF(100 mL)溶液中緩慢滴加TEA(8.5 g,87 mmol),滴畢,將混合物移至室溫下攪拌反應(yīng)6 h。TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完畢。減壓濃縮,加入乙酸乙酯溶解,用飽和碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液洗一次,飽和氯化銨(NH4Cl)水溶液洗一次,有機相再用5 mol·L-1HCl洗滌一次,有機相用無水硫酸鈉干燥,抽濾,減壓濃縮得白色固體9.1 g,收率92.1%。ESI-MS m/z: 352.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.80 (t,J=6.2 Hz, 1H), 7.56～7.46 (m, 3H), 7.37～7.26 (m, 3H), 7.17 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 4.50 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H).

2.2.3 N-((4-(2,2-二氰基-1-甲氧基乙烯基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X6)的制備

將X5(9 g,25.6 mmol)加入原甲酸三甲酯(TMOF)(80 mL)的溶液中,升溫到100 ℃攪拌反應(yīng)10 h。TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完畢。減壓濃縮得棕色油狀物8 g,直接用于投下一步反應(yīng),收率85.1%。ESI-MS m/z: 366.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.94 (t,J=6.2 Hz, 1H), 7.69～7.62 (m, 2H), 7.60～7.48 (m, 3H), 7.35 (ddd,J=9.0, 7.9, 3.3 Hz, 1H), 7.19 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 4.61 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.90 (d,J=2.2 Hz, 6H).

2.2.4 N-((4-(5-氨基-4-氰基-1-((1S)-2,2,2-三氟-1-甲基乙基)-1H-吡唑-3-基)苯基)甲基)-5-氟-2-甲氧基苯甲酰胺(X7)的制備

冰浴條件下將(1,1,1-三氟丙烷-2-基)肼鹽酸鹽(77 mg,0.59 mmol)溶于EtOH(2 mL)溶液中,滴加TEA(55 mg,0.54 mmol),攪拌30 min,然后再將上述溶液滴加入X6(200 mg,0.54 mmol)的EtOH溶液中,將混合物移至室溫下攪拌反應(yīng)12 h。TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完畢。溶液冷卻到0 ℃,抽濾,固體用EtOH洗3次,置于真空干燥箱干燥過夜,得白色固體200 mg,收率80.3%。ESI-MS m/z: 462.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.84 (t,J=6.1 Hz, 1H), 7.75 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.51 (dd,J=9.2, 3.3 Hz, 1H), 7.43 (d,J=8.0 Hz, 2H), 7.33 (td,J=8.5, 3.3 Hz, 1H), 7.18 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 7.09 (s, 2H), 5.30 (p,J=6.7 Hz, 1H), 4.53 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 1.65 (d,J=6.8 Hz, 3H).

2.2.5 LOXO-305(1)的制備

將X7(200 mg,0.43 mmol)加入甲基磺酸(MsOH)(2 mL)的溶液中,于85 ℃攪拌反應(yīng)3 h。TLC監(jiān)測原料反應(yīng)完畢。用NaOH溶液調(diào)pH至11左右,有固體析出,抽濾,固體用水洗3次,置于真空干燥箱干燥過夜,得黃色固體120 mg,收率(58.2%),純度為99.5%[HPLC面積歸一化法,色譜柱為Horizon C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A為體積分數(shù)0.1%的三氟乙酸水溶液,流動相B為乙腈(梯度洗脫:0～1 min B 5%～20%, 1～11 min B 20%～40%, 11～11.2 min B 40%～95%, 11.2～13.2 min B 95%, 13.2～13.5 min B 95%～5%, 13.5～15 min B 5%);檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:40 ℃]。ESI-MS m/z: 480.1[M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ8.84 (t,J=6.1 Hz, 1H), 7.51 (dd,J=9.2, 3.3 Hz, 1H), 7.44 (q,J=8.1 Hz, 4H), 7.37～7.30 (m, 1H), 7.18 (dd,J=9.1, 4.3 Hz, 1H), 6.67 (s, 2H), 5.29 (p,J=7.2 Hz, 1H), 4.55 (d,J=6.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 1.61 (d,J=6.8 Hz, 3H).

3 結(jié)果與討論

3.1 中間體X3的方法優(yōu)化

在合成化合物X3時,原研路線分為兩步,先使用二氯亞砜作酰化試劑,將中間體制成酰氯,隨后再與4-氨甲基苯甲酸偶聯(lián)得到中間體X3,反應(yīng)過程中既要控水,還要氮氣保護,操作煩瑣,而且受4-氨甲基苯甲酸溶解度的影響,總反應(yīng)時長達20 h,且存在原料剩余問題。本工藝路線改用低成本的CDI縮合劑,兩原料物質(zhì)的量比為1∶1時一步反應(yīng)即可得到中間體X3,室溫下僅3 h即可反應(yīng)完全,且不存在原料剩余問題,大大縮短了反應(yīng)時間,收率提高至98.2%,后處理只要調(diào)節(jié)pH至3～4,減壓濃縮一定量的溶劑,過濾干燥即得化合物X3,此步反應(yīng)后處理避免了打漿操作,在保證純度和收率的同時,簡化了操作,更符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。

3.2 中間體X5的方法優(yōu)化

在合成化合物X5時,原研路線分為兩步,先使用二氯亞砜作酰化試劑,將中間體制成酰氯,隨后再與丙二腈偶聯(lián)得到中間體X5,反應(yīng)過程中既要控水,還要氮氣保護,操作煩瑣,總反應(yīng)時長達20 h;本工藝路線改用縮合劑EDCI,一步反應(yīng)即可得到中間體X5,室溫下僅6 h即可反應(yīng)完全,大大縮短了反應(yīng)時間,收率提高至92.1%,后處理只要用堿水和酸水洗去反應(yīng)體系中的HOBT,即得化合物X5,在保證純度和收率的同時,簡化了操作,更符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。

3.3 中間體X6的方法優(yōu)化

在合成化合物X6時,原研路線需要在92 ℃反應(yīng)18 h;本工藝路線將溫度提高至100 ℃,反應(yīng)時長降低至10 h,很大程度上減少了反應(yīng)時間,后處理只要旋蒸去除TMOF,直接投下一步反應(yīng)即可,在保證后一步收率的同時,簡化了操作。

4 結(jié)論

本文改進了LOXO-305的合成路線,以5-氟-2-甲氧基苯甲酸為起始原料,經(jīng)兩步簡單的縮合反應(yīng)得到關(guān)鍵中間體X5,很大程度地減少了反應(yīng)時長,降低了合成成本。中間體X5經(jīng)甲基化、關(guān)環(huán)反應(yīng)、水解反應(yīng)得到目標(biāo)化合物L(fēng)OXO-305,純度為99.5%,改進后的工藝路線總收率為35.9%。該方法使用的試劑簡單易得,后處理操作簡便,產(chǎn)物純化多采用水洗,避免柱層析分離,便于放大生產(chǎn),可為LOXO-305及其衍生物的合成提供參考。