自體骨髓濃縮物和富血小板血漿治療膝關節軟骨損傷

馮玉嬌,周田華,李明軍,陳志安,呂曉雨,王剛,徐永清,譚洪波*

(1.昆明醫科大學,云南 昆明 650000;2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院骨科,云南 昆明 650000)

膝關節作為人體的主要承重關節,軟骨損傷很常見。軟骨組織因缺乏血管、軟骨細胞增殖遷移能力差、細胞外基質復雜等原因[1-2],導致其愈合潛力有限。患者膝關節軟骨損傷后,關節內微環境隨之改變,多種炎癥因子繼發性產生,若同時關節腔內存在滑膜增厚、滑膜炎癥、游離體等情況,關節腔內微環境會繼續惡化,進一步影響關節軟骨損傷的修復過程[3]。通過關節鏡清理術(arthroscopic debridement,AD)去除不穩定或分層的軟骨瓣、游離體等不利因素,可緩解疼痛并解除機械卡壓癥狀,創造更利于軟骨修復的環境[4-5]。但大量研究表明,軟骨損傷后采用單純AD療效欠佳[3]。AD聯合生物制劑、生物材料或化學藥物等治療更有利于軟骨修復[6],其中生物制劑因自身攜帶各類可修復軟骨的細胞成分及生長因子等而倍受關注。目前臨床應用較多的生物制劑有富血小板血漿(platele rich plasma,PRP)、骨髓濃縮物(bone marrow aspirate concentrate,BMAC)、間充質干細胞、肉毒桿菌毒素、皮質類固醇、透明質酸等[2]。其中BMAC和PRP相較于其他生物制劑制取方便且為患者自身組織,患者接受度較高;同時一般認為BMAC或PRP可以促進軟骨修復[7-8]。有研究表明BMAC或PRP治療可通過改善關節腔內炎性環境、釋放促進軟骨愈合的各類生長因子等途徑促進軟骨修復,部分患者癥狀及功能改善甚至可持續到術后12個月[9]。但同時有少數研究認為PRP注射對軟骨損傷不能起到修復作用[10],甚至加重膝關節腫脹、疼痛[11],這可能與具體的制取、使用方式及評價指標有關。目前AD聯合PRP或BMAC的報道較少,兩者療效差異及具體影響尚不明確。本研究納入2020年7月到2021年8月中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院應用AD治療的62例膝關節軟骨損傷患者資料,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標準:(1)年齡18～65歲;(2)身體質量指數(body mass index,BMI)為18～30 kg/m2;(3)經影像學檢查證實為膝關節軟骨損傷,膝關節軟骨損傷<2 cm2,國際軟骨修復學會(international cartilage repair society,ICRS)分級Ⅰ～Ⅱ級,軟骨下骨無損傷;(4)關節內存在滑膜增生、滑膜炎、游離體等需進行關節清理術的情況;(5)下肢無明顯X型腿或O型腿;(6)近1年膝關節局部未進行過其他藥物注射治療。排除標準:(1)骨質疏松明顯;(2)骨骼未成熟者;(3)力線不良者;(4)存在半月板損傷、交叉韌帶和側副韌帶斷裂或三者術后未痊愈者;(5)膝關節嚴重積液;(6)使用皮質類固醇和免疫抑制劑;(7)一般健康狀況不佳,酗酒或濫用藥物;(8)既往接受過自體血液制品或干細胞制劑治療。本研究獲得了本院倫理委員會批準[倫審2020-021(科)-01],并在中國臨床實驗中心完成注冊(ChiCTR2100054792);受試者均知情同意,并簽署知情同意書。

本研究共納入62例單側膝關節軟骨損傷患者,其中男29例,女33例;年齡18～65歲,平均(32.57±8.58)歲;平均BMI(23.02±1.26)kg/m2。患者術前MRI顯示膝關節軟骨有損傷跡象,且關節內有不同程度滑膜增生、游離體存在等情況,ICRS I級30例,Ⅱ級32例。患者既往慢性病為高血壓、糖尿病、冠心病等,接受治療時慢性病病情控制平穩。根據隨機數字分類法將患者分為三組,AD+BMAC組(AD聯合BMAC注射)22例,AD+PRP組(AD聯合PRP注射)18例,AD組(單純AD治療)22例。三組患者一般資料差異無統計學意義(P>0.05,見表1),具有可比性。

表1 患者一般資料比較

1.2 材料制備

1.2.1 BMAC制備 (1)患者取側臥位,髂后上棘定位后,洗手、消毒、帶手套,鋪洞巾。確定穿刺點位置,以2%利多卡因行皮膚、皮下組織和骨膜麻醉。(2)骨穿針髂后上棘穿刺,進針3～5 cm,進入穿刺位置后,連接裝有1 mL肝素鈉抗凝液的10 mL注射器[12-13]。(3)抽取骨髓同時晃動注射器,使骨髓液跟注射器內的肝素鈉充分混合;同時旋轉調整骨穿針頭端開口位置,避免骨髓液稀釋。(4)采集的骨髓液18 mL+2 mL肝素鈉鈉抗凝液共20 mL放入離心管內,以1 000 g離心力離心10 min。(5)離心后可見骨髓分為3層,上層為淡黃色漿液層,中間為黃褐色有核細胞層,下層為深紅色細胞層。(6)5 mL注射器空針插入試管蓋下進行排氣,避免提取過程中負壓形成空氣渦流影響分層。(7)20 mL注射器連接吸血針插入液面下1 mL處吸取上層漿液層,注意離心管應始終保持垂直直立狀態以保持分層清晰存在,液面下降時針頭應隨之下降。(8)抽取至漿液層剩余2 mL,然后充分搖晃離心管,將有核細胞層充分混入剩余漿液層內。抽取出此混合物即可得到最終BMAC(見圖1)。BMAC在制備后10 min內完成注射。

a 髂后上棘穿刺抽取骨髓 b 骨髓離心后分為3層 c 制備好的BMAC圖1 BMAC制備過程

1.2.2 PRP制備 (1)評估患者上肢靜脈血管情況后,扎止血帶、消毒鋪巾,采血針采血。(2)應用離心管收集血液,同時晃動離心管,使血液與管內的枸櫞酸鈉充分混合。(3)每例患者采集18 mL靜脈血放入離心管內,以1 500 g離心力單次離心10 min。(4)離心結束后,血漿和血細胞已分層。(5)5 mL注射器空針插入試管蓋下進行排氣。(6)20 mL注射器連接吸血針插入液面下1 mL處吸取上層血漿,液面下降時針頭應隨之下降。(7)抽取至血漿剩余2 mL,然后充分搖晃離心管,將有血小板層充分混入剩余血液層內。抽取出此混合物即可得到最終PRP(見圖2)。PRP在制備后10 min內完成注射。

a 離心后血漿和血細胞分層 b 制備好的PRP圖2 PRP制備過程

1.3 手術方法 檢査術前影像確認患肢,患者仰臥位,麻醉成功后消毒、鋪巾。患膝屈曲,膝關節鏡進行全面檢查,確定軟骨損傷位置及損傷情況。刨削病變滑膜,清理游離體,磨削增生的骨贅;清除膝關節內受損的軟骨、硬化骨質等,直至暴露出正常軟骨,使軟骨缺損區周圍正常軟骨邊緣垂直于缺損平面;徹底清理膝關節內碎屑、多余滑膜等;充分止血,充分清洗后盡量吸除關節內液體。AD+BMAC組將制備好的2 mL BMAC注入關節腔內,AD+PRP組將制備好的2 mL PRP注入關節腔內,AD組將2 mL生理鹽水注入關節腔內。縫合術口,無菌敷料覆蓋,紗布繃帶包扎。

所有患者的BMAC、PRP提取均由同一醫生完成,關節鏡術均由同一位高年資關節外科醫生操作(若關節鏡術中發現患者軟骨損傷不符合納入標準則剔除出組)。數據收集人員未參與注射,單人完成數據統計分析。

1.4 術后處理 患者注射后無疼痛,則不需服用任何處方藥或非處方藥;若疼痛難忍需向研究人員報告,并遵囑服藥。患者在注射后第4～5天開始持續被動運動,1周后開始負重,2周后可完全負重,建議在6個月時進行輕度體育活動(如游泳、騎自行車或慢跑),12個月后可參加不受限制的體育活動。

1.5 觀察指標 注射前及注射后1、3、6、12個月采用Lysholm膝關節評分、Tegner運動能力評分、疼痛數字評分法(numeric rating scales,NRS)[8,14]評估患者癥狀及功能改善情況,通過患者書面填寫問卷或由訓練有素的醫療專業人員通過電話評估獲得。注射前及注射后12個月由1名骨科醫生和1名經驗豐富的放射科醫生采用三維磁共振軟骨修復組織觀察(magnetic resonance observation of cartilage repair tissue,MOCART)評分[15],評估軟骨修復情況。

回顧性分析本院骨關節科2016年1月～2017年1月行TKA或UKA手術治療的494位患者。其中199例符合上述標準，納入本研究，其中男39例，女160例，平均年齡（69.84±6.43）歲。199個病例中，行UKA 94個膝關節，男20例，女74例；行TKA 105個膝關節，男14例，女91例。兩組患者一般資料見表1，兩組在年齡、性別構成、BMI、手術側別的差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2 結 果

62例患者均獲得12個月以上完整隨訪,平均隨訪時間(14.16±0.94)個月。

2.1 Lysholm評分(見表2和圖3) 三組組間比較,術前差異無統計學意義(P>0.05),術后1、3個月差異有統計學意義(P<0.05),術后6、12個月差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 三組Lysholm膝關節評分比較 圖4 三組Tegner運動能力評分比較 圖5 三組NRS評分比較

表2 三組患者Lysholm評分比較分)

AD+BMAC組術后1、3、6個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。AD+PRP組術后1、3個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后6、12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。AD組術后1個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后3、6、12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 Tegner評分(見表3和圖4) 三組組間比較,術前差異無統計學意義(P>0.05),術后1、3個月差異有統計學意義(P<0.05),術后6、12個月差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 三組患者Tegner評分比較分)

AD+BMAC組術后1、3、6個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。AD+PRP組術后1、3個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后6、12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。AD組術后1個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后3、6、12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 NRS評分(見表4和圖5) 三組組間比較,術前差異無統計學意義(P>0.05),術后1、3個月差異有統計學意義(P<0.05),術后6、12個月差異無統計學意義(P>0.05)。

表4 三組患者NRS評分比較分)

AD+BMAC組、AD+PRP組術后1、3、6個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。AD組術后1個月與術前比較差異有統計學意義(P<0.05),術后3、6、12個月與術前比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 MOCART評分比較(見表5和圖6) 三組組間比較,術前差異均無統計學意義(P>0.05);術后12個月AD+BMAC組、AD+PRP組略優于AD組,差異無統計學意義(P>0.05)。術后12個月三組患者MRI顯示,軟骨損傷均未加重,與術前比較均有改善,但MOCART評分與術前比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

圖6 三組MOCART評分比較

表5 三組患者MOCART評分比較分)

2.5 典型病例 (1)37歲女性患者,因“左膝疼痛不適12個月”入院,診斷為左股骨軟骨損傷,行AD聯合BMAC治療,術畢給予止痛、制動等處理,術后患者疼痛減輕,手術前后影像學資料見圖7～8。(2)35歲男性患者,因“右膝疼痛不適20個月”入院,診斷為右股骨軟骨損傷,行AD聯合PRP治療,術畢給予止痛、制動等處理,術后患者疼痛減輕,手術前后影像學資料見圖9～10。

圖9 術前MRI示右股骨軟骨損傷 圖10 術后12個月MRI示軟骨缺損仍存在

3 討 論

PRP是一種通過離心、分層分離等操作將外周血轉變為含高濃度血小板的血漿制劑的一種制備方法,研究表明PRP中同時富含各類生長因子和抗炎細胞因子[16]。BMAC是通過將采集的自體骨髓離心,以濃縮血小板和骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal ceu,BMSCs)為目的進行制備[17-18],研究表明BMAC中的血小板、有核細胞濃度較未濃縮骨髓液增加了4倍[17],同時從中還檢測出各類生長因子如血小板源性生長因子、人骨形態發生蛋白(human bone morphogenetic protein,BMP)-2等[13]。近年來,PRP及BMAC治療膝關節疾病仍是生物制劑治療的研究熱點之一。

根據文獻報道,當軟骨損傷面積<3 cm2可采用生物制劑注射療法[6],參考MRI及關節鏡下檢查,本研究對符合各項標準的ICRS Ⅰ～Ⅱ級膝關節軟骨損傷患者應用AD聯合BMAC或PRP治療,比較分析其療效結果表明,相較于單純AD,輔助聯合PRP或BMAC注射均能更顯著改善患者癥狀、促進膝關節功能恢復。就PRP而言,本研究結果與Kon等[19]的研究結果一致,關節內PRP注射有助于膝關節軟骨缺損患者的恢復。Laver等[20]、Bansal等[21]也曾開展試驗對比PRP和透明質酸的療效,大部分研究結果顯示PRP組的效果好于透明質酸。機制上講,這可能與PRP中富含各類生長因子和抗炎細胞因子有關。研究表明PRP中的生物活性因子能夠恢復關節內透明質酸含量[22-23],增加糖胺聚糖和Ⅱ型膠原的合成,重建滑膜液穩態和促進組織修復[24];同時研究顯示PRP在軟骨治療中具有生物膠功能,可調節關鍵的促炎介質和分解代謝酶,維持關節內穩態[25-26]。這不僅有利于去除壞死組織,減少炎癥反應,而且有利于關節軟骨的修復和再生。BMAC作為臨床相關的抗炎和再生生物治療的來源,在治療膝關節損傷方面同樣有效[6]。因BMAC來源于骨髓,研究普遍將其作用重點歸功于其富含BMSCs。具體來講,BMSCs可發揮招募作用,釋放生長因子,誘導干細胞遷移到損傷區域并發揮抗炎作用;同時BMSCs的成軟骨細胞分化和旁分泌信號產生強大的透明軟骨修復組織反應,對修復軟骨損傷有巨大的潛力[25,35]。總之本研究結果支持輔助聯合PRP或BMAC使用能有效改善患者癥狀、促進膝關節功能恢復。

重要的是,本研究結果顯示每個隨訪時間段AD+BMAC組患者癥狀及功能改善均優于AD+PRP組。這與Chahla等[7,28-29]的研究結果一致,BMAC較PRP治療關節軟骨局灶性損傷效果更佳。從機制上講,BMAC除了含有PRP中存在的血小板和細胞生長因子外,還具備PRP沒有的可促進軟骨修復的其他生長因子如BMP-2、BMP-7[13],這些生長因子都已經被證明有利于促進軟骨再生;同時BMAC因其骨髓來源、自身含有更豐富的BMSCs,而BMSCs在抗炎和組織愈合修復中發揮了至關重要的作用[30-31]。總之,可能得益于BMAC更豐富的干細胞和細胞因子成分,本研究中關節鏡聯合BMAC注射產生更優的治療效果。

同時本研究發現,大部分患者短期內改善明顯,長期效果不理想。這可能是因為BMAC、PRP中的許多生長因子等細胞成分具有有限的生物半衰期[32-33],其作用時間受到限制。同時軟骨組織修復修復過程中需要足夠的微環境給予支撐,應用關節鏡結合生物制劑創造了良好的初始微環境,然而軟骨缺損依然存在,且術后患者未完全制動,這有可能引起進一步軟骨損傷的發生從而破壞微環境平衡,可能是短期內改善效果滿意、長期改善不佳的原因。本研究顯示PRP和BMAC注射后對癥狀、功能起到明顯治療效果分別能持續到到術后3個月和6個月;該結果可以為有效治療時限的確定、注射次數及治療周期的調整干預提供有效的參考。

在影像學分析中,本研究三組治療12個月后MRI顯示軟骨損傷未進一步加重,但三組未發現明顯的軟骨修復差異。多項臨床研究均報道了類似結果[21,34-35]。本研究中未出現明顯新生軟骨組織的原因可能為BMAC、PRP注射次數為1次,其所含相關細胞因子及生長因子半衰期較短,不能持續進行12個月的軟骨修復作用;也可能因為關節局部軟骨修復效果不明顯,不能被常規MRI全部識別及顯示,本研究中MRI觀察序列為T1、T2序列,未應用基于MRI的形態成像和成分成像的成分MRI技術及特殊序列評估軟骨修復程度,可能成像及評分不能精確反映軟骨修復全部細節[15]。雖然MRI結果上觀察各組差異無統計學意義,但BMAC+AD組、PRP+AD組患者各項功能評分較AD組均得到了明顯提升,可見BMAC、PRP可阻止軟骨損傷的進一步惡化,延緩了膝關節軟骨損傷患者的骨關節炎進展。

本臨床研究具有其局限性:考慮到每位患者可獲得的BMAC、PRP樣品量較少,未檢測BMAC、PRP所含細胞成分及生長因子種類;同時考慮到患者骨髓采集后疼痛的持續時間,未進行多次BMAC、PRP注射;未檢測患者關節液,不能對患者關節內微環境進行監測。

綜上所述,相較于單純AD,AD聯合BMAC或PRP均能取得滿意的近期療效,可顯著緩解癥狀和改善功能;AD聯合BMAC效果優于PRP且作用持續時間更長。術后12個月影像學上評估BMAC和PRP注射對軟骨修復有所幫助、能阻止膝關節損傷進一步惡化,但其優勢不顯著,有待進一步評估和研究。