細胞外液谷氨酸激活星形膠質細胞的離體實驗研究*

左婷，高洋，石來敏，袁良杰

（山東第一醫科大學臨床與基礎醫學院，山東 濟南 250000）

星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的膠質細胞，參與突觸、神經回路和行為調節等功能［1］。星形膠質細胞和神經元緊密嵌入腦組織，在突觸處共享突觸連接［2］谷氨酸（glutamate,Glu）是中樞神經系統中的一種興奮性神經遞質，神經細胞外液中殘留的Glu 通常會導致神經興奮性毒性［3］。星形膠質細胞通過攝取突觸釋放到突觸間隙的Glu 防止Glu 興奮毒性［4］。星形膠質細胞通過谷氨酸轉運蛋白清除細胞外液中殘留的Glu。細胞外Glu 刺激星形膠質細胞胞內儲存的鈣離子的釋放，觸發星形膠質細胞向相鄰神經元釋放谷氨酸［5］。因此，星形膠質細胞通過維持Glu 攝取和釋放保持中樞神經系統中Glu 的穩態。大量研究表明，Glu 穩態的打破與精神性疾病、阿爾茨海默病和肌萎縮側索硬化癥等疾病的發生具有重要的關系［6-7］。研究發現，Glu 興奮毒性主要與神經膠質細胞的能力受損有關［8］。星形膠質細胞是再攝取Glu 的主要細胞。然而，不同濃度的Glu 對星形膠質細胞的影響尚不清楚，因此本研究將揭示不同濃度Glu 對星形膠質細胞的影響，這將為拮抗Glu 的興奮性毒性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

谷氨酸粉末由Sigma 公司提供；β-actin（ab8227）購自Abcam（英國劍橋）；膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）抗體由Cell Signaling Technology 公司提供；抗兔和抗鼠二抗購自Absin Bioscience Inc.（中國上海）。DMEM 培養基、青鏈霉素雙抗均購自美國GIBCO 公司，胎牛血清購自北京Cell Max 公司。

1.2 原代星形膠質細胞培養及處理

采用1～2 d 新生SD 大鼠制備原代星形膠質細胞［9］。從大鼠腦海馬組織中分離出星形膠質細胞。取量大鼠腦兩側海馬組織，0.125% 胰蛋白酶-0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）在37℃下消化海馬組織15 min。用含有10% FBS 的DMEM 終止消化。將海馬組織吹散成單個細胞，并以1×104/cm2的密度接種在含有10% FBS 的DMEM 的75 cm2培養皿中。24 h 后，用新鮮的完全培養基（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM）替換培養基，并去除懸浮細胞。細胞在37℃、95% 空氣、5%CO2培養箱中培養約8 d，細胞生長融合達到90%以上。以210 r/min（18 h，37℃）旋轉培養皿用于收集純化的星形膠質細胞。細胞GFAP 陽性染色率＞98%。不同濃度的谷氨酸（0 μM、25 μM、50 μM、100 μM）與細胞共同作用24 h。

1.3 Western blot 實驗技術檢測蛋白表達

不同濃度谷氨酸刺激細胞24 h 后，棄掉培養板中的上清液，預冷的0.01 M PBS 沖洗3 遍，加入RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，用細胞刮將細胞輕輕刮下，收集裂解液到離心管中，4℃ 12 000 r/min轉速離心20 min，吸取上清液。采用BCA 法檢測蛋白濃度后，加入5×loading buffer 充分混勻，95℃孵育5 min；然后將蛋白保存于-80℃冰箱，用于Western blotting 檢測。將保存好的蛋白，按照每孔15 μg 的蛋白質量進行電泳；電泳結束后，300 mA 恒壓轉膜90 min，將帶有蛋白條帶的PVDF 膜封閉于5% 的脫脂牛奶1 h，然后一抗孵育，4℃搖床24 h；然后TBST 洗膜3 遍，二抗孵育，室溫1 h；然后加入發光液進行蛋白檢測。采用Image J 軟件讀取蛋白灰度值，進行蛋白含量的分析。

1.4 統計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 5.0 統計軟件。實驗結果用均數±標準差（）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用Tukey 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 不同濃度的谷氨酸對星形膠質細胞GFAP 蛋白表達的作用

為了檢測不同濃度的外源性谷氨酸對星形膠質細胞的激活作用，本實驗選用星形膠質細胞的標志物GFAP 進行檢測，結果顯示，不同濃度的谷氨酸處理星形膠質細胞24 h，與0 μM 組相比，25 μM，50 μM，100 μM 的谷氨酸處理組GFAP 的蛋白表達均有上調的趨勢，100 μM 處理組GFAP表達明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗數據見表1。

表1 不同濃度的谷氨酸誘導星形膠質細胞GFAP和IL-1β 蛋白的表達（）

表1 不同濃度的谷氨酸誘導星形膠質細胞GFAP和IL-1β 蛋白的表達（）

注：?與0 μM 組比較，P＜0.05。

2.2 不同濃度谷氨酸誘導星形膠質細胞釋放炎性因子IL-1β 蛋白的作用

研究表明激活的星形膠質細胞會釋放炎性因子IL-1β，為了檢測不同濃度的谷氨酸是否能夠激活星形膠質細胞，本實驗使用不同濃度的谷氨酸處理星形膠質細胞24 h，利用Western blot 技術檢測炎性因子IL-1β 的表達，結果顯示，50 μM 和100 μM 谷氨酸處理組，IL-1β 蛋白的表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

3 討論

星形膠質細胞參與神經退行性疾病、精神性疾病的復雜病理機制。神經元和星形膠質細胞通過調節神經遞質谷氨酸/谷氨酰胺循環來維持中樞神經系統神經傳遞的平衡［4］。星形膠質細胞能夠調節谷氨酸和離子穩態、膽固醇和鞘脂代謝，并對環境因素刺激做出反應，以上都是與神經系統疾病有關［10］。谷氨酸是中樞神經系統中興奮性神經元釋放的最普遍的神經遞質之一；然而，細胞外空間中殘留的谷氨酸具有潛在的神經毒性，突觸和突觸外谷氨酸的過量導致神經元過度興奮和神經元死亡，這一過程被稱為“谷氨酸興奮毒性”［11］。正常情況下，谷氨酸在神經細胞內的濃度很高，然而，在細胞外液中卻保持很低的水平約為3～4 μM［12-13］。因為在星形膠質細胞存在清除過量谷氨酸的轉運蛋白，可將中樞神經系統中90%的過量谷氨酸清除和轉運［14-15］。目前尚不清楚細胞外高濃度谷氨酸是否能刺激星形膠質細胞發生炎癥反應？為了闡明這些現象，在本研究中，筆者用不同濃度的谷氨酸（0 μM、25 μM、50 μM、100 μM）刺激星形膠質細胞24 h。結果發現，與0 μM 組相比，100 μM 谷氨酸處理組GFAP 蛋白表達明顯升高，50 μM 和100 μM 谷氨酸處理組IL-1β蛋白水平明顯提高，這說明星形膠質細胞在轉運過量谷氨酸的過程中被激活，炎癥因子的釋放可能促進谷氨酸在細胞間隙的進一步釋放［16］，促炎因子水平增加，也會導致星形膠質細胞轉運谷氨酸的能力下降，從而形成炎癥反應和谷氨酸興奮性毒性增加的惡性循環。然而，在高濃度谷氨酸的內部環境中，星形膠質細胞是否發生了其他變化，還需要進一步的整體動物水平的實驗驗證。

綜上所述，本實驗研究證實了高水平的細胞外谷氨酸可以誘導星形膠質細胞激活并釋放促炎細胞因子。本研究將為拮抗谷氨酸的興奮性毒性提供實驗依據。