基于數(shù)據(jù)挖掘的蟹殼殼聚糖提取工藝

高 鑫，曾 明，楊宗政，曹井國

(1.天津科技大學化工與材料學院，天津 300457；2.天津科技大學海洋與環(huán)境學院，天津 300457)

殼聚糖(chitosan)是一種無毒無味、白色或灰白色、半透明、廣泛存在于自然界中的天然高分子聚合物[1]。它主要存在于甲殼類動物、昆蟲和真菌中，通過甲殼素脫乙酰基而得到，當脫乙酰度達到50%以上時，殼聚糖溶解性能大幅提高[2-3]。作為一種堿性多糖，殼聚糖的氨基可以連接不同的活性基團，具有不同的生物活性，如抗菌性、吸濕性和生物相容性等，被廣泛應用于制藥、生物醫(yī)學、美容和食品包裝領域[4]。

化學法、生化法及微生物法都可以從蝦蟹殼中提取殼聚糖。生化法和微生物法比化學法更綠色，但仍有一些障礙需要克服，如發(fā)酵過程中部分菌株會改變、破壞α-甲殼素的晶體結(jié)構(gòu)，降低殼聚糖脫乙酰度，因此不能廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)。化學法成本較低且適合大規(guī)模生產(chǎn)，蝦蟹廢物可以快速實現(xiàn)可持續(xù)利用并應用于商業(yè)生產(chǎn)[5-6]。近年來，大數(shù)據(jù)分析被用于解決各種工業(yè)問題，然而通過數(shù)據(jù)挖掘分析殼聚糖的化學提取過程還沒有被進一步研究[7]。

本文總結(jié)近年來使用化學法提取殼聚糖的研究文獻，采用斯皮爾曼相關(guān)性分析和冗余分析法分析脫乙酰過程中氫氧化鈉質(zhì)量濃度、反應溫度、反應時間與脫乙酰度的相關(guān)性。運用Box-Behnken 中心設計實驗得出甲殼素脫乙酰基的最佳反應條件。最后，對實驗提取的蟹殼殼聚糖進行表征分析，為研究人員開發(fā)和優(yōu)化殼聚糖回收方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

蟹殼廢料由天津中盛生物工程有限公司提供，蟹殼廢料用清水清洗干凈，40 ℃烘干，粉碎后備用。商品殼聚糖(脫乙酰度為80%～95%)購自國藥集團化學試劑有限公司。提取所用試劑均為分析純試劑。

1.2 數(shù)據(jù)挖掘與處理

從文獻庫中檢索與殼聚糖化學提取相關(guān)的研究圖片，使用Origin 軟件對圖片中的數(shù)據(jù)[8-16]進行提取和處理。利用斯皮爾曼相關(guān)性熱圖和冗余分析相關(guān)矩陣，評價脫乙酰度與幾個反應條件之間的相關(guān)性。在熱圖中，若脫乙酰度與某一影響因素相關(guān)性的P值小于0.05，則表示顯著相關(guān)，如果P 值小于0.01，則表示極顯著相關(guān)。冗余分析的相關(guān)性取決于兩個因素之間的角度，銳角表示正相關(guān)，鈍角表示負相關(guān)，直角表示不相關(guān)[17-19]。

1.3 甲殼素和殼聚糖的提取

取若干蟹殼粉用質(zhì)量分數(shù)為4%的鹽酸浸泡，置于30 ℃的搖床中持續(xù)振蕩24 h，超純水反復沖洗沉淀至濾液為中性，在50 ℃下烘干。將沉淀用質(zhì)量濃度為0.04 kg/L 的氫氧化鈉溶液浸泡，100 ℃反應6 h，用超純水洗凈沉淀，在50 ℃下烘干沉淀，獲得蟹殼甲殼素粗品。通過數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果確定脫乙酰過程影響因素的范圍，運用響應面設計實驗得出蟹殼甲殼素脫乙酰的最佳反應條件，將甲殼素粗品進行脫乙酰化反應，提取殼聚糖。

1.4 驗證實驗

按照響應面優(yōu)化條件進行殼聚糖提取實驗驗證，測定殼聚糖脫乙酰度和提取率，實驗重復3 次。

1.5 脫乙酰度測定

參照行業(yè)標準FZ/T 50037—2017《殼聚糖纖維脫乙酰度試驗方法》測定殼聚糖脫乙酰度，脫乙酰度計算公式見式(1)。

式中：D 為脫乙酰度；c1為鹽酸標準滴定溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；V1為加入鹽酸標準滴定溶液的體積，mL；c2為氫氧化鈉標準滴定溶液的物質(zhì)的量濃度，mol/L；V2為滴定所消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL；16 為自由氨基的摩爾質(zhì)量的數(shù)值；m為殼聚糖質(zhì)量，g；0.099 4 為理論氨基含量。

1.6 殼聚糖表征

使用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)、掃描電子顯微鏡(SEM)和X 射線衍射(XRD)技術(shù)對最優(yōu)條件下制得的殼聚糖進行表征，通過XRD 圖譜比較殼聚糖的結(jié)晶度。FTIR 的掃描范圍為400～4 000 cm-1，XRD 的掃描范圍為5°～60°。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫乙酰度與其他因素的相關(guān)性分析

反應條件對脫乙酰度影響的斯皮爾曼相關(guān)性分析和冗余分析法分析結(jié)果如圖1 所示。

圖1 反應條件對脫乙酰度影響的斯皮爾曼相關(guān)性分析和冗余分析法分析結(jié)果Fig.1 Spearman correlation analysis and redundancy analysis results of the effect of reaction conditions on deacetylation degree

從圖1 中可以看出：固液比和脫乙酰度之間存在一定的負相關(guān)性，表明隨著固液比的增大，脫乙酰度逐漸下降；氫氧化鈉質(zhì)量濃度、反應溫度和反應時間與脫乙酰度呈正相關(guān)。

2.2 殼聚糖脫乙酰條件優(yōu)化

基于數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果，設計實驗：氫氧化鈉質(zhì)量濃度為0.1～0.5 kg/L，反應溫度為80～120 ℃，反應時間為2～6 h，實驗因素與水平見表1。姜金壯[20]設置固液質(zhì)量比為1∶100，考慮到實際實驗效果以及實驗環(huán)境，本實驗確定固液質(zhì)量比為 1∶50，Box-Behnken 實驗設計與數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表2。

表1 響應面設計因素與水平Tab.1 Response surface design factors and levels

表2 Box-Behnken實驗設計與數(shù)據(jù)分析結(jié)果Tab.2 Box-Behnken experimental design and data analysis results

利用Desgin-Expert 13 響應面軟件進行二次多元回歸擬合，得出蟹殼殼聚糖脫乙酰度對3 個單因素的二次回歸模型，見式(2)。

殼聚糖脫乙酰度的統(tǒng)計學分析結(jié)果表明，各因素之間存在顯著的相關(guān)性。由回歸模型的方差分析結(jié)果可知，P＜0.000 1，表明模型高度顯著，回歸方程結(jié)果與實驗結(jié)果較吻合，實驗誤差小；P失擬＝0.233 1＞0.05，說明模型失擬度不顯著。模型的調(diào)整決定系數(shù)為98.89%，方程擬合程度良好，實驗誤差較小，可以用此模型對殼聚糖脫乙酰度進行分析和預測。

反應條件對脫乙酰度影響的響應面圖如圖2 所示。從圖2(a)中可以看出：反應時間為4 h 時，氫氧化鈉質(zhì)量濃度和反應溫度的交互作用明顯，對殼聚糖脫乙酰度有正向的影響；隨著氫氧化鈉質(zhì)量濃度和反應溫度的增大，脫乙酰度逐漸增大，當氫氧化鈉質(zhì)量濃度為0.5 kg/L 時，脫乙酰度達到最高，表明此時為脫乙酰反應的最佳質(zhì)量濃度。

圖2 反應條件對脫乙酰度影響的響應面圖Fig.2 Response surface graph of the effect of reaction conditions on deacetylation degree

圖2(b)表明：當反應溫度為100 ℃時，脫乙酰度隨著氫氧化鈉質(zhì)量濃度與反應時間的增加而增加。圖2(c)表明：反應時間與反應溫度對脫乙酰過程無顯著影響，延長反應時間，脫乙酰度增加不明顯。根據(jù)響應面優(yōu)化結(jié)果得出，殼聚糖脫乙酰最優(yōu)提取工藝條件為：氫氧化鈉質(zhì)量濃度 0.5 kg/L、反應溫度110 ℃、反應時間6 h。在此工藝條件下，殼聚糖脫乙酰度可以達到93.18%。

2.3 驗證實驗

驗證實驗結(jié)果見表3。從表3 中可以得出，殼聚糖脫乙酰度最高為93.43%，提取率最大為19.66%，與響應面分析結(jié)果一致，表明工藝穩(wěn)定可靠。

表3 驗證實驗結(jié)果Tab.3 Validation test results

2.4 基于數(shù)據(jù)挖掘的對比分析

基于數(shù)據(jù)挖掘和實驗數(shù)據(jù)的反應條件對脫乙酰度的影響如圖3 所示。

圖3 基于數(shù)據(jù)挖掘和實驗數(shù)據(jù)的反應條件對脫乙酰度的影響Fig.3 Effect of reaction conditions on deacetylation degree based on data mining and experimental data

由圖3 可知，隨著氫氧化鈉質(zhì)量濃度、反應溫度的升高，殼聚糖的脫乙酰度不斷增大，與數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果基本一致。在常規(guī)工藝中，脫乙酰基反應在0.4～0.8 kg/L 的氫氧化鈉溶液中進行，所得脫乙酰度為70%～85%[8-16,21]。在本實驗中，當氫氧化鈉質(zhì)量濃度為0.1 kg/L 時，脫乙酰度小于40%，而氫氧化鈉質(zhì)量濃度達到 0.5 kg/L 時，脫乙酰度最大值可達90.78%。甲殼素在脫除乙酰基時，高分子鏈結(jié)構(gòu)阻礙OH-與羰基的結(jié)合，隨著堿液濃度的增加，溶液中OH-濃度增大，OH-與羰基得到充分接觸。當反應溫度升高時，體系內(nèi)的分子運動加快，分子間碰撞概率增大，殼聚糖脫乙酰度大幅增加，在溫度為100 ℃時，脫乙酰度達到最大。從圖3(c)實驗數(shù)據(jù)可知，反應時間對脫乙酰度的影響為正相關(guān)，部分實驗數(shù)據(jù)低于挖掘數(shù)據(jù)，原因是挖掘數(shù)據(jù)中存在部分物理輔助提取方法(如微波加熱等)的實驗結(jié)果，在相同時間下，這些結(jié)果表現(xiàn)出較高的脫乙酰度[12]。

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

紅外光譜可以反映殼聚糖的化學結(jié)構(gòu)，包括其共同的特征峰和特殊的振動[22]，理論上殼聚糖在1 650、1 620 和1 550 cm-1處有特征峰。上述響應面最優(yōu)條件下提取的蟹殼殼聚糖與商品殼聚糖的紅外光譜對比圖如圖4 所示。在3 300～3 400 cm-1和2 871～2 920 cm-1處的特征峰，分別對應殼聚糖的—OH 和 —CH 的拉伸振動；位于1 650 cm-1和1 557 cm-1處的特征峰，分別對應酰胺Ⅰ的伸縮振動和酰胺Ⅱ的彎曲振動；本文樣品的特征峰與商用殼聚糖基本一致。另外，通過紅外光譜中1 620～1 660 cm-1的振動模式，可以區(qū)分α-殼聚糖和β-殼聚糖。

圖4 殼聚糖紅外光譜圖對比Fig.4 Comparison of chitosan infrared spectra

α-殼聚糖在1 660 cm-1和1 627 cm-1處可觀察到2 個特征峰，而β-殼聚糖在1 656 cm-1處只有1 個特征峰存在[23-24]。樣品殼聚糖在1 650 cm-1和1 622 cm-1附近有2 個特征峰，屬于α-殼聚糖。

2.6 掃描電子顯微鏡分析

利用掃描電子顯微鏡對樣品進行觀察，不同倍數(shù)的蟹殼殼聚糖的掃描電子顯微鏡圖如圖5 所示。在低倍數(shù)下，殼聚糖表面光滑、平整，部分區(qū)域可以看見孔隙；隨著倍數(shù)的增大，可以觀察到表面薄片的無規(guī)則排列，有很明顯的層狀結(jié)構(gòu)。這是由于殼聚糖脫乙酰化反應后發(fā)生解聚，原本聚集的塊狀薄片被打散為更多的單層薄片結(jié)構(gòu)，這與Kucukgulmez 等[25]從貝殼中提取殼聚糖的結(jié)果一致。

圖5 殼聚糖的掃描電子顯微鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy of chitosan

2.7 X射線衍射分析

一般來說，蝦和蟹外骨骼中甲殼素和殼聚糖在2θ 為9°～10°和20°～21°處有2 個衍射峰，當殼聚糖分子間和分子內(nèi)氫鍵較強時，表現(xiàn)為更高的結(jié)晶度和更緊密的結(jié)構(gòu)[9-10]。通過X 射線衍射，對商品殼聚糖和蟹殼殼聚糖進行分析，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 殼聚糖XRD圖譜對比Fig.6 Comparison of XRD diffraction patterns of chitosan

兩種殼聚糖均在20°處存在尖銳的峰，呈現(xiàn)出非晶體結(jié)構(gòu)。不同于商品殼聚糖的是，蟹殼殼聚糖在10°處出現(xiàn)新的衍射峰，峰強度低于20°時的峰強度，可能是因為存在結(jié)合水[9]，符合蝦蟹殼聚糖的衍射峰變化[26]。

3 結(jié)論

(1)利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)、箱式圖、斯皮爾曼相關(guān)性分析和冗余分析法對甲殼素脫乙酰基過程進行統(tǒng)計分析，得出脫乙酰度與其他因素的相關(guān)性：氫氧化鈉質(zhì)量濃度、反應時間、反應溫度與殼聚糖脫乙酰度呈正相關(guān)。

(2)本次實驗主要以蟹殼為原料提取殼聚糖，響應面實驗結(jié)果表明脫乙酰過程最優(yōu)工藝條件為：氫氧化鈉質(zhì)量濃度 0.5 kg/L、反應時間 6 h、反應溫度110 ℃。該條件下脫乙酰度達到89.53%。與數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果相比，殼聚糖的脫乙酰度得以優(yōu)化，實現(xiàn)了蟹殼資源的有效利用。

(3)表征結(jié)果證明本文所得蟹殼殼聚糖結(jié)構(gòu)屬于α-殼聚糖，呈片狀結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度較低。