NIR 控制的復合型納米MOF 用于耐藥菌滅活

閆 泳，鄭 碩，毛麗穎，高 霞

(天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

由病原微生物感染引發的傳染病一直是世界范圍內舉足輕重的公共衛生問題[1-3].準確、快速識別并殺滅病原微生物對疾病控制至關重要。這對致病性細菌來說尤其如此。數據顯示每年全球約有5.5 億人因致病菌住院，并至少有3 300 萬人因此死亡[4]。在已知的病原體中，金黃色葡萄球菌(S.aureus)是最常見的食源性致病菌之一，它們在極低的傳染劑量下即可導致嚴重疾病，除常見的食物中毒外，其繼發性感染更是會導致腦膜炎、脊髓炎、敗血癥等，甚至 死亡[5-7]。

1929 年，弗萊明發現青霉素，開啟了抗生素對抗細菌感染的輝煌時代。但是，伴隨抗生素的大規模使用甚至濫用，細菌的耐藥性問題日趨嚴重，對人類生命健康造成巨大的威脅[8-9]。某些致病菌對其常用抗生素的耐藥檢出率已達50%以上，如耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌的平均檢出率為76%，大腸埃希菌對頭孢曲松或頭孢噻肟的耐藥率已達54.2%[10-11]。據世界衛生組織估計，到2050 年，由細菌耐藥性引發的全球死亡人數將達1 000 萬人[12]。我國在2016 年頒布了《遏制細菌耐藥國家行動計劃(2016—2020年)》，旨在遏制細菌耐藥性，維護人民群眾健康。因此，發展快速有效的耐藥菌滅活方法，及時遏制細菌的傳播具有十分重要的現實意義。

近年來，光致細菌滅活法尤其是光熱療法(photothermal therapy，PTT) 和光動力療法(photodynamic therapy，PDT)，因其具有侵入性小、長期副作用小、成本低且不產生顯著耐藥性等優點而備受關注[13-16]。PTT 是指利用近紅外光吸收劑將光轉化為熱進行殺菌的一種方式，而PDT 是利用光敏劑在光激發下將氧氣(O2)轉化為生物毒性活性氧(reactive oxygen species，ROS)進行殺菌。與此同時，納米材料及技術的日新月異也為耐藥性細菌的高效滅活提供了契機[17-19]。金屬有機骨架(metal-organic frameworks，MOF)材料就是一類可以用來構建光致細菌滅活平臺的理想材料[20-22]。MOF 是以金屬離子為連接點，有機配體為支撐構成的空間3D 延伸的多孔性材料，具有多種優異性能，如大的比表面積、可調控的空間結構以及易于修飾的表面。MOF 具有孔隙結構，可以用來負載光熱劑和光敏劑；其結構具有靈活性，可通過對其表面的功能化實現對目標病原菌的特異性識別。

因此，本研究構建了基于復合型 MOF 材料(UiO/ICG/PFH@aptamer，縮寫為UIP@Apt)的細菌滅活平臺。區別于傳統的抗生素，UIP@Apt 具有制備方法簡單、成本低、周期短、具有廣譜性殺菌能力且不易產生顯著的細菌耐藥性的優勢；同時，其具有良好的生物相容性和細菌靶向性，長期副作用小，其主要功能成分吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)已被食品藥品監督管理局批準用于臨床。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

2-疊氮對苯二甲酸(BDC-N3)，南京圣賽化工有限公司；八水合氧氯化鋯(ZrOCl2·8H2O)、吲哚菁綠(ICG)、全氟己烷(perfluorohexane，PFH)，Sigma-Aldrich 公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰醋酸、溴化鉀，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；營養瓊脂、胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、酵母提取物，北京索萊寶科技有限公司；鈣黃綠素、碘化丙啶，北京華威銳科化工有限公司。所用 aptamer(3′-DBCOATATACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATG CTATTTTTT-5′)[23]在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有溶液均用電阻率為18 MΩ·cm 去離子水制備。

Talos 型透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)，FEI 公司；D/max-2500 型X 射線衍射儀，日本理學集團公司；LUMINA 型熒光光譜儀，賽默飛世爾科技公司；UV-2600 型分光光度計，日本島津公司；Tensor-27 型傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克公司；倒置熒光顯微鏡，日本尼康公司；JY600C型聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)儀，北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 UIP@Apt的合成

將50 mg BDC-N3和21 mg ZrOCl2·8H2O 溶于1 mL DMF 溶液中。將混合溶液超聲處理10 min 后，與750μL 乙酸一并轉移到聚四氟乙烯不銹鋼高壓反應釜中，在90 ℃烘箱中加熱18 h，得到UiO-66-N3。待反應液慢慢冷卻至室溫后，用DMF 溶液和純凈水分別洗滌3 次(12 000 r/min 離心10 min)，將其置于 60 ℃真空干燥12 h，得到UiO-66-N3納米晶體的金屬有機骨架。最后將所得納米顆粒懸浮于純凈水中，放在4 ℃冰箱中保存。

將100μg/mL UiO-66-N3與40μg/mL ICG 水溶液混合后，在機械搖床上室溫避光振蕩12 h，隨后用純凈水清洗3 次(12 000 r/min 離心10 min)去除游離ICG。所得的UiO@ICG 沉淀與100μL 4% PFH 避光孵育6 h，再洗滌3 次后復溶于純凈水中，得到UIP復合材料。隨后將其在60 ℃真空干燥箱中干燥過夜，可得UIP 粉末樣品。

將100μg/mL UIP 與2μmol/L 二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)修飾的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)核酸適配體(DBCO-aptamer)混合于pH 8.5 碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液中，置于機械搖床上，在室溫下振蕩過夜。最后，用純凈水洗去游離aptamer，重新懸浮納米材料獲得UIP@Apt。

UIP@Apt 的合成及其用于MRSA 滅活的原理如圖1 所示。以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)為模型菌，在有近紅外光(NIR)照射時，一方面ICG可作為光熱劑產熱殺菌，另一方面ICG 也是光敏劑，可將O2轉化為單線態氧(1O2)進行殺菌。同時，PFH具有相轉變特性，在受熱時可瞬間釋放O2，促使ICG產生更多1O2，進一步增強其殺菌能力。因此，利用構建的UIP@Apt 納米平臺，可實現對耐藥菌的快速精準識別與滅活。

圖1 UIP@Apt的合成及其用于MRSA滅活的原理圖Fig.1 Synthesis of UIP@Apt and its application for MRSA inactivation

1.3 細菌培養

挑取活化好的MRSA 菌落置于LB 液體培養基，200 r/min、37 ℃培養12 h；3 500 r/min 離心5 min除去培養基，再用PBS 緩沖液洗滌3 次，最后重新懸浮于PBS 緩沖液中。采用平板涂布法確定細菌的濃度，利用分光光度計測定不同細菌濃度下600 nm 處的吸光度(A600)，將平板涂布濃度(CFU/mL)與A600建立對應關系，后續致病菌濃度可通過A600計算。

1.4 體外殺菌

將MRSA(1×105CFU/mL)與PBS(10 mmol/L，20μL)、UiO、UiO/ICG 及UIP@Atp(終質量濃度均為200μg/mL)孵育 10 min 后接種到 96 孔板中，用808 nm 激光以每孔0.5 W/cm2輻射照度照射10 min。將20μL 稀釋100 倍的細菌懸浮液轉移到LB 固體培養基上，37 ℃孵育12 h。根據LB 固體培養基上的菌落分布計數，計算不同處理條件下的殺菌效率。此外，利用鈣黃綠素和碘化丙啶對不同條件處理下的細菌進行染色，通過激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal scanning laser microscope，CLSM)觀察細菌的生存情況。利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)對對照組(PBS)和最終處理組(UIP@Apt＋NIR) 的MRSA 細菌形貌進行觀察，評估其殺菌機制。

1.5 生物膜抑制

將高濃度MRSA 細菌(1×107CFU/mL)置于96孔板中，在胰酪大豆胨液體培養基(TSB)37 ℃培養6 h 后，分別進行PBS(10 mmol/L，20μL)和UIP@ Atp＋NIR(UIP@Atp 終質量濃度分別為200μg/mL和400μg/mL，激光照射時間為10 min)處理，隨后繼續置于37 ℃培養箱中培養18 h。如此進行3 個周期，即72 h 后對孔板中的生物膜進行結晶紫染色，通過檢測其在590 nm 處的吸光度，并對結晶紫染色的面積進行統計分析，以此評估UIP@Atp＋NIR 處理對生物膜的抑制效果。同時，對生物膜進行鈣黃綠素和氧化丙啶染色，通過3D CLSM 圖像觀察UIP@ Atp＋NIR 對生物膜中MRSA 細菌的殺菌效果。

2 結果與分析

2.1 UiO-66-N3 的表征

以2-疊氮對苯二甲酸為配體，以鋯(氧氯化鋯)為中心金屬，通過水熱法一步合成了富含疊氮基團的UiO-66-N3(圖2)。

圖2 UiO-66-N3 的TEM圖像、元素分析、XRD和傅里葉變換紅外光譜表征Fig.2 TEM image，element mapping，XRD and Fourier transform infrared spectrum spectra of UiO-66-N3

對合成的UiO-66-N3進行了TEM 表征，如圖2(a)所示，合成的UiO-66-N3尺寸在納米級別，并呈現出典型的八面體結構，這與文獻報道的一致[23-24]。對其進行了元素分析，如圖2(b)所示，配體中含有的碳元素、氮元素及中心離子鋯元素均出現在了合成的材料中，初步說明UiO-66-N3已經成功合成。為了進一步驗證這一結論，對合成材料進行了X 射線衍射(XRD)表征〔圖2(c)〕和傅里葉變換紅外光譜表征〔圖2(d)〕。合成的納米粒子在小角度范圍內(小于10°)呈現出了其特征的XRD 峰[24]，且在2 116 cm-1處出現了疊氮基團的紅外光譜特征吸收峰，這些結果進一步驗證了UiO-66-N3的成功合成。

2.2 UIP@Apt的表征

以UiO-66-N3為初始材料，通過包覆ICG 和PFH，并通過點擊化學反應修飾MRSA 靶向適配體，制備了UIP@Apt 復合納米MOF 材料。為了驗證材料的成功合成，對其進行了相應的表征。利用CLSM考察ICG 是否已經被包裹在UiO-66-N3中。由于納米級別的材料難以被CLSM 觀察到，在此合成了具有完全一致結構的微米尺寸的UiO-66-N3[25]。如圖3所示，微米級別的UiO-66-N3在明場下同樣呈現出典型的八面體結構，當以相同的方法包裹ICG 后，可觀察到明顯的熒光信號，且其位置與UiO-66-N3完全耦合，說明ICG 成功被包覆在UiO-66-N3中。

圖3 微米尺寸UiO-66-N3的CLSM圖Fig.3 CLSM diagram of micron sized UiO-66-N3

對UIP@Apt 的水溶液進行808 nm 激光照射，隨著激光照射時間的延長，可在溶液中觀察到明顯的氣泡〔圖4(a)〕。這是由于ICG 吸收了近紅外激光產熱后，觸發了PFH 的相轉變特性釋放出O2，這一結果間接證明了PFH 也被成功包覆在UiO-66-N3中。

圖4 UIP@Apt的表征Fig.4 Characterization of UIP@Apt

為了驗證DBCO 修飾的細菌適配體已通過點擊化學反應鍵合在UiO-66-N3上，首先對兩者的反應產物進行了傅里葉變換紅外光譜表征。如圖4(b)所示，在與DBCO 修飾的適配體反應完成后，UiO-66-N3在2 116 cm-1處的特征峰強度明顯降低，說明其上存在的疊氮基團已部分與DBCO 發生了點擊化學反應。

此外，對單純的 UiO-66-N3及適配體修飾的UiO-66-N3(UiO@Apt)進行了凝膠分析。如圖4(c)所示，單純的MOF 材料沒有呈現出任何的條帶，而UiO@Apt 可呈現出明顯的DNA 條帶，進一步說明了aptamer 已鍵合在了UiO-66-N3上。

2.3 UIP殺菌機理的驗證

ICG 是一種近紅外熒光染料，其在NIR 照射下，既可產熱殺菌又可產ROS 殺菌。為了驗證其在UIP中仍具備此雙重功能，首先用DCFH-DA 探針對UIP產ROS 的能力進行驗證。DCFH-DA 是一種可以用來檢測體系中是否存在ROS 的熒光探針。當有ROS存在時，其在525 nm 處會產生特征的熒光發射峰。如圖5(a)和圖5(b)所示，只有當ICG 存在且有NIR照射時，材料(UiO/ICG 和UIP)才會產生ROS〔圖5(a)，紅線和黑線〕，且隨著PFH 的進一步引入，材料(UIP)產ROS 的能力大大增強〔圖5(a)，黑線〕。結果說明：一方面，ICG 在NIR 照射下具備產ROS的能力；另一方面，PFH 的引入確實會大大增強這一 能力。

圖5 UIP殺菌機理的驗證Fig.5 Validation of UIP sterilization mechanism

為了進一步驗證PFH 的存在確實會產生O2，考察了[Ru(dpp)3]Cl2(RDPP)探針在不同乏氧體系中的熒光強度變化。RDPP 是一種可以特異性檢測O2存在的熒光探針，其在615 nm 處的特征熒光發射峰會被O2猝滅。如圖5(c)和圖5(d)所示，在乏氧情況下，當材料中不存在PFH 時，無論是否有激光照射，體系中RDPP 的熒光強度變化范圍均不大；而當有PFH 存在且有NIR 照射時，RDPP 的熒光強度急劇下降〔圖5(c)，黑線〕，說明體系中有大量的O2產生。這一結果間接驗證了復合型UIP 材料在NIR 照射時，其光熱作用可使PFH 發生相轉變釋放O2，從而增強ICG 的光動力效果。這一結果也說明了包覆在MOF 中的ICG 仍然保留了其光熱性能。如圖5(e)所示，單純的MOF 在NIR 照射下溫度基本恒定(黑線)，而包覆了ICG 的UiO/ICG 和UIP 的溫度隨著激光照射時間的延長而升高，進一步驗證了ICG在被包覆在MOF 中后仍保留了其光熱性能。這里需要說明的是，UIP 的光熱效應(藍線)略微低于UiO/ICG(紅線)，這可能是由于PFH 的加入占據了MOF 的部分孔隙結構，導致ICG 的包覆量降低引起的。

此外，圖5(f)的實驗結果顯示被包覆在MOF 中的ICG 具有更好的抗光漂白能力，相較于單純的ICG，UIP 具有更好的光熱循環性能。在經過4 次光熱循環實驗后，單純ICG 可達到的最高溫度已從52 ℃降低到35 ℃，而UIP 仍可以達到近44 ℃。上述實驗結果均為UIP 用于后續的殺菌實驗提供了理論依據。

2.4 UIP@Apt體外殺菌性能

為了考察UIP@Apt 復合納米材料對MRSA 的殺菌性能，設置了不同的處理組：PBS 對照組、PBS＋NIR 組、UiO 處理組、UiO＋NIR 組、UiO/ICG處理組、UiO/ICG ＋NIR 組、UIP@Apt 處理組、UIP@Apt＋NIR 組。首先采用了平板培養法考察不同處理組中MRSA 的生長情況，直觀地了解不同處理方法對MRSA 的殺菌效果。如圖6(a)所示，在無NIR 照射時，4 個處理組中MRSA 的生長活性基本沒有顯著差異，其菌落數量也很相近〔圖6(b)〕。這一結果說明單純的材料處理沒有明顯的殺菌作用，而當引入NIR 照射時，各組之間MRSA 的生長情況發生變化。由于PBS 和UiO 材料本身都不具備光熱劑或光敏劑的作用，因此其菌落數與無NIR 時的基本一致，細菌的生長并不受太大的影響。不同的是，在UiO/ICG＋NIR 組中，MRSA 菌落數顯著降低，這是ICG 在激光照射下同時產熱和產ROS 殺菌導致的，其殺菌率在47.9%左右。當進一步引入PFH 后，ICG在產熱的同時，還可促使PFH 釋放O2，此后ICG 又進一步在NIR 照射下將O2轉換為ROS 殺菌。ROS只能在較短距離內發揮作用，而aptamer 的存在大大拉近了UIP 材料與細菌之間的距離，可使產生的ROS 充分發揮其殺菌作用。基于此，在UIP@Apt 的靶向作用以及光熱和自供氧光動力協同作用下，UIP@Apt＋NIR 處理組對MRSA 的殺菌率達到了96.5%。

圖6 UIP@Apt體外殺菌性能Fig.6 In vitro bactericidal performance of UIP@Apt

對不同組別處理后的細菌進行了熒光染色實驗，其中：鈣黃綠素可以特異性染色活細菌，呈現綠色熒光；碘化丙啶可特異性染色死細菌，呈現紅色熒光。染色結果如圖6(c)所示，在沒有激光照射時，4 個處理組都呈現出了大量的綠色熒光，說明細菌活性并沒有受到太大影響。在有NIR 照射時，除PBS＋NIR 組和UiO＋NIR 組內細菌仍保持較好活性外，UiO/ICG＋NIR 和UIP＋NIR 處理后的細菌均呈現出了顯著的紅色熒光，說明已有大量的細菌被滅活。圖6(d)的SEM 圖片也驗證了這一結論，經UIP@Apt＋NIR 處理后的MRSA 細菌已出現了顯著的皺縮和變形。

上述體外數據均說明UIP@Apt 具有NIR 觸發的殺菌特性，其殺菌能力一方面來自其光熱性能，另一方面來自其自供氧型的光動力殺菌能力。這種聯合殺菌行為可大大提高殺菌效率，使UIP@Apt 在低劑量(微克級別)時即可達到較好的殺菌效果。同時，這一殺菌機理具有廣譜適用性，既可以用于殺滅普通細菌且不產生耐藥性，又可以直接用于多藥耐藥菌的滅活。

2.5 UIP@Apt用于生物膜抑制

生物膜由于其外排泵、分離效應和基因突變，對傳統的抗菌藥物具有更強的耐藥能力。因此，抗生素在用于生物膜治療時，往往由于耐藥性和穿透效果不佳而使治療效果不理想[26]。基于此，除殺菌性能外，還研究了UIP@Apt 體外抑制MRSA 生物膜形成的 能力。

將高濃度的MRSA 置于96 孔板中，然后分別添加 PBS、200μg/mL UIP@Apt+NIR 及 400μg/mL UIP@Apt+NIR，考察其生物膜的生長情況。經過相同時間培養后，對各處理組內的生物膜進行結晶紫染色，檢測其在590 nm 處的吸光度并統計其結晶紫染色面積，結果如圖7 所示。PBS 處理組的生物膜形成較為致密完整，A590較大，而UIP@Apt＋NIR 處理的生物膜相對輕薄甚至透明且呈現出較小的A590，說明UIP@Apt＋NIR 可以有效抑制MRSA 生物膜的形成。由A590計算得出，200μg/mL UIP@Apt 在NIR 照射下對生物膜形成的抑制率為33.5%，400μg/mL UIP@Apt＋NIR 對生物膜形成的抑制率為68.5%。此外，生物膜結晶紫染色的面積統計結果也支持了這一結論，在NIR 照射下，相較于PBS 對照組，UIP@Apt處理后的MRSA 生物膜呈現出較小的結晶紫染色 面積。

圖7 UIP@Apt體外抑制MRSA生物膜形成的能力Fig.7 UIP@Apt ability to inhibit the formation of MRSA biofilm in vitro

對不同方法處理后的生物膜進行鈣黃綠素染色，并利用3D CLSM 技術對其進行成像，如圖7(d)所示。不論是從3D 視角還是從俯視視角，均能觀察到UIP@Apt＋NIR 處理后的生物膜中存活的細菌數量明顯減少，生物膜變薄且更加透明，進一步驗證了UIP@Apt＋NIR 對MRSA 生物膜的生長有良好的抑制作用。

3 結論

基于MOF 的易修飾性和多孔特性，結合光化學機理，本實驗設計并合成了一種復合型MOF 納米材料，其不但具備對目標細菌的靶向性，且在NIR 的觸發下可進行光熱和自供氧光動力協同殺菌，具有侵入性小、長期副作用小且不產生顯著耐藥性等優點。以MRSA 為模型菌，經驗證，在NIR 控制下其體外殺菌率可達96.5%。相較于傳統治療方法，UIP@Apt 能有效抑制生物膜的形成。該方法簡單有效，可為耐藥性細菌的早期識別與滅活提供有益參考。