亞鐵結合卵黃高磷蛋白肽的制備及活性分析

宋璐杉，宋 麗，朱臨嫻，喬賽鳳，張曉維

(天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

鐵的吸收調控是人體維持機體鐵穩態的關鍵，鐵攝入不足和吸收障礙往往會導致人體缺鐵。缺鐵性貧血(iron deficiency anemia，IDA)是最常見的營養缺乏癥之一，研究表明IDA 會導致兒童生長發育抑 制[1]、免疫抑制[2]、精神疾病[3]等，此外，還會增加孕婦分娩風險、導致老年人器官功能下降等[4]。因此，IDA 在全球范圍內引起了很多國家的關注[5]，美國、加拿大等國家采用了鐵強化小麥面粉等方式補鐵[6]，然而這種補鐵方式收效甚微。

人體對鐵的吸收主要來源于動物食物的血紅素鐵和植物食物的非血紅素鐵，其中血紅素鐵的吸收受飲食成分的影響較小，而非血紅素鐵的吸收受飲食成分的影響很大[7]。非血紅素鐵通常以亞鐵離子(Fe2+)和鐵離子(Fe3+)兩種形式存在，通常以Fe(OH)3絡合物的形式存在，然而只有亞鐵離子才能被十二指腸腸上皮細胞吸收，鐵離子需要被還原成亞鐵離子才能被吸收[8]。血紅素鐵的吸收機制尚未被完全揭示，可能依賴于血紅素載體蛋白1(HCP1)和血紅素應答基因1(HRG-1)轉運或受體介導的內吞作用[9]。因此，亞鐵離子螯合物可能更有利于小腸細胞吸收。

肽與金屬離子的螯合物作為新型的礦物質補充劑，不僅具有良好的穩定性，而且還能提高金屬元素的吸收效果[10]。卵黃高磷蛋白(phosvitin，PV)是生產磷酸肽的良好來源[11]，它由217 個氨基酸殘基組成，其中124 個為絲氨酸殘基，由于90%以上的絲氨酸殘基被磷酸化，因此具有較高的抗氧化活性和金屬螯合活性[12]。研究[13]表明，每100 g 雞蛋含有2 mg 鐵，其中有95%的鐵與PV 結合，鐵與PV 結合的化學平衡常數K＝1018。PV 因其與金屬離子結合不易解離而不利于人體對金屬離子的吸收[14]，酶解后得到的卵黃高磷蛋白肽(phosvitin peptide，PP)能夠顯著提高Fe2+、Ca2+的生物利用度[15]。與PV 相比，PP 具有更高的抗氧化能力和亞鐵螯合能力[16]。國內外關于PP螯合金屬離子的研究主要集中在PP-鈣螯合物方面，PP-亞鐵螯合物方面的研究相對較少，因此本研究以PV 為原料，優化酶解條件，超濾分離篩選活性更高的多肽組分，旨在為進一步開發卵黃高磷蛋白肽亞鐵螯合物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞蛋，天津市濱海新區第十三大街洞庭路明耀超市。

堿性蛋白酶(200 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(250 U/mg)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、Folin-酚、聚乙二醇(PEG)6000(AR)，北京索萊寶科技有限公司；氯化亞鐵四水合物(GR)、菲啰嗪(AR)、鹽酸羥胺(AR)，上海麥克林生化科技有限公司；FRAP 抗氧化能力檢測試劑盒，ABTS 抗氧化能力檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；無水碳酸鈉(AR)、五水合硫酸銅(AR)、氫氧化鈉(AR)等，國藥集團化學試劑有限公司。

H1850 型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BK-FD105 型冷凍干燥機，山東博科生物產業有限公司；MK3 型酶標儀，美國BIO-TEK公司；DKB-501A 型恒溫振蕩搖床，上海森信實驗儀器有限公司；DK-98-2 型電熱恒溫水浴鍋，上海虔鈞科學儀器有限公司；實驗室pH 計、電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；超濾離心管(截留相對分子質量 30 000、10 000 和 3 000)，德國Sartorius 公司。

1.2 方法

1.2.1 卵黃高磷蛋白的制備

采用NaCl 結合聚乙二醇(PEG6000)沉淀法[17]制備PV。收集新鮮雞蛋的蛋黃液，加入等質量蒸餾水，4 ℃磁力攪拌1 h，10 000g 離心10 min，收集沉淀，加入等質量NaCl(0.17 mol/L)溶液，4 ℃磁力攪拌1 h，10 000g 離心10 min，再次收集沉淀加入1.74 mol/L NaCl 溶液(體積質量比為10)，完全溶解后調節pH＝4，添加PEG6000 至質量分數為3%，4 ℃磁力攪拌1 h，10 000g 離心10 min，取上清液透析48 h 后再10 000g 離心10 min，取上清液冷凍干燥即為PV。

1.2.2 卵黃高磷蛋白的酶解工藝優化

選擇3 種蛋白酶酶解PV，酶解條件參考表1。PV 溶解后用Lowry 法[18]測定蛋白質質量濃度，調節PV 質量分數為5%，調節pH，加入蛋白酶后轉移到恒溫振蕩搖床，反應結束后，95 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫。

表1 3種蛋白酶的反應條件Tab.1 Reaction conditions of three proteases

單一酶酶解時間的確定：以PV 水解度、酶解液的 T-AOC 以及鐵螯合活性為指標，酶添加量為6 000 U/g，酶解時間分別控制在1、2、3、4、5、6 h，按照表1 的條件酶解。

單一酶酶添加量的確定：選擇酶的最佳酶解時間，控制酶添加量分別為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g，按照表1 的條件酶解。

復合酶酶解：單一酶的酶解條件確定后，將堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分步組合確定復合酶的酶解工藝。

1.2.3 卵黃高磷蛋白肽的分級分離

采用截留相對分子質量為 30 000、10 000 和3 000 的離心超濾管，7 500g 離心1 h，分別得到相對分子質量范圍為＞30 000、10 000～30 000、3 000～＜10 000 和＜3 000 的PP 組分。

1.2.4 多肽及蛋白質含量的測定

采用靈敏度高的Lowry 法[18]測定多肽及蛋白質的含量。以250μg/mL 的牛乳血清蛋白為標準溶液，配制成質量濃度為 0、25、50、100、150、200、250μg/mL 的蛋白溶液，按Folin-酚試劑使用說明書進行操作，在755 nm 處測定吸光度，以蛋白質質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。參照Folin-酚試劑使用說明書的方法測定樣品的吸光度，代入標準曲線計算含量。

1.2.5 水解度的測定

以蛋白質在三氯乙酸(TCA)中的溶解度作為PV的水解度(ωDH)。將酶解液與等體積20% TCA 混合，10 min 后10 000g 離心15 min，用Lowry 法測定上清液中多肽的質量濃度[19-20]。水解度按照式(1)計算。

式中：ρ1為上清液中多肽的質量濃度，ρ2為樣品中蛋白質的質量濃度。

1.2.6 亞鐵螯合活性和亞鐵結合量的測定

采用菲啰嗪分光光度法[20]測定肽的亞鐵螯合活性。向200μL 酶解液加入800μL 醋酸鈉緩沖液(200 mmol/L，pH 5)，再加入40μL 2 mmol/L FeCl2溶液，振蕩搖勻后靜置30 min，加入40μL 5 mmol/L 菲啰嗪溶液，10 min 后在562 nm 處測定有色絡合物 吸光度，蒸餾水作空白對照。測定肽結合的亞鐵的 量[21]。亞鐵螯合活性(d1)和亞鐵結合量(d2)分別按照式(2)和式(3)計算。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為樣品的吸光度；m0為反應液中添加Fe2+的質量，μg；m1為未結合多肽的Fe2+質量，μg；m2為反應液中多肽的質量，mg。

1.2.7 抗氧化活性分析

T-AOC：用T-AOC 檢測試劑盒測定酶解液的總抗氧化能力。T-AOC 可以反映酶解液還原Fe3+-三吡啶三吖嗪產生藍色Fe2+-三吡啶三吖嗪的能力。以20μmol/L FeSO4溶液為標準溶液，按試劑盒說明書操作，以Fe2+濃度為橫坐標，593 nm 處吸光度變化值為縱坐標，繪制標準曲線，測定酶解液T-AOC 值，單位為U/mL。

ABTS：以Trolox 為標準品進行ABTS 抗氧化能力檢測，把10 mmol/L Trolox 標準溶液稀釋成0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L，按ABTS 抗氧化能力檢測試劑盒說明書進行操作，測定734 nm 處吸光度變化值，繪制標準曲線，進而求得樣品的ABTS抗氧化能力，單位為μmol/mg。

FRAP：采用FeSO4作為標準品進行FRAP 抗氧化能力檢測，將適量100 mmol/L FeSO4溶液稀釋為0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mmol/L，按FRAP 抗氧化能力檢測試劑盒說明書操作，測定593 nm 處吸光度變化值，繪制標準曲線，進而求得樣品的FRAP抗氧化能力，單位為μmol/mg。

1.3 數據處理

所有實驗進行3 次平行實驗，用SPSS Statistics 21 軟件處理數據，采用ANOVA 對各組數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 3 種蛋白酶酶解時間對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC的影響

卵黃高磷蛋白與酪蛋白有相似的結構與組成，酪蛋白水解后能與鐵離子螯合，形成肽-鐵螯合物，且該螯合物能被Caco-2 細胞良好吸收[22]。本實驗選擇了3 種不同的蛋白酶水解卵黃高磷蛋白，并對PV 的水解度、PP 的亞鐵螯合活性和T-AOC 進行評價。水解度越高，說明酶解后產生的多肽越多；亞鐵螯合活性越高，說明多肽結合亞鐵離子的活性越高；T-AOC越高，說明多肽還原Fe3+-三吡啶三吖嗪產生藍色Fe2+-三吡啶三吖嗪的能力越強。

水解度是反映蛋白質水解程度的指標，受酶解時間的影響，酶解時間越長，蛋白質水解越徹底，水解度就越高，即多肽含量越多、相對分子質量越小[23]。3種蛋白酶酶解時間對水解度的影響如圖1 所示。隨著酶解時間的延長，卵黃高磷蛋白的水解度均增大。前4 h 水解度增長迅速，之后增長速度趨于平緩。在蛋白酶添加量相同時，3 種蛋白酶酶解卵黃高磷蛋白的效果不同，堿性蛋白酶的水解能力最高，胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解能力次之。

圖1 3種蛋白酶酶解時間對水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time of three proteases on hydrolysis degree

酶的種類和酶解時間會影響酶解液中多肽的種類和含量，從而影響酶解液的亞鐵螯合活性[24]。由于PV 與亞鐵離子結合不易解離而不利于亞鐵的生物利用，本研究關注的是酶解物的活性，因此研究結果不以未酶解的PV 作為對照。3 種蛋白酶的酶解時間對亞鐵螯合活性的影響如圖2 所示。堿性蛋白酶酶解1 h 時亞鐵螯合活性最高，胰蛋白酶酶解2 h 時亞鐵螯合活性最高，胃蛋白酶對酶解液的亞鐵螯合活性影響不大。

圖2 3種蛋白酶的酶解時間對亞鐵螯合活性的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time of three proteases on ferrous chelating activity

蛋白質的抗氧化活性與水解度有關，水解度過大或過小時，抗氧化活性都有可能下降[25]。3 種蛋白酶的酶解時間對T-AOC 的影響如圖3 所示。堿性蛋白酶酶解3～4 h，T-AOC 最高；隨著胰蛋白酶酶解時間的延長，T-AOC 逐漸減小；隨著胃蛋白酶酶解時間的延長，T-AOC 逐漸增大。

圖3 3種蛋白酶的酶解時間對T-AOC的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time of three proteases on TAOC

綜上所述，盡管堿性蛋白酶酶解1 h 時，亞鐵螯合活性最高，但水解度較低且產生的多肽較少，所以堿性蛋白酶酶解時間取3 h，此時亞鐵螯合活性和TAOC 均較高。胰蛋白酶酶解2 h 時，亞鐵螯合活性和T-AOC 均達到最高，因此胰蛋白酶的酶解時間取2 h。由圖1—圖3 可知，胃蛋白酶酶解時，隨著酶解時間的延長，水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC 均緩慢增加，且酶解5 h 和酶解6 h 時各指標差異不大，因此胃蛋白酶酶解時間取5 h。由于PV 不易被酶解，采用單一酶酶解水解度較低，得到的活性多肽較少，因此有必要采用復合酶進行酶解。

2.2 3 種蛋白酶的添加量對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC的影響

在堿性蛋白酶酶解3 h、胰蛋白酶酶解2 h、胃蛋白酶酶解5 h 條件下，探究不同蛋白酶添加量對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC 的影響，結果如圖4—圖6 所示。

圖4 3種蛋白酶添加量對水解度的影響Fig.4 Effect of addition amount of three proteases on hydrolysis degree

由圖4 可知：水解度隨著酶添加量的增加呈現先增加后趨于平緩的趨勢，當堿性蛋白酶和胰蛋白酶添加量為6 000 U/g 時，可能由于酶達到飽和狀態，水解度增加很小。由圖5 可知：隨著堿性蛋白酶添加量的增加，亞鐵螯合活性逐漸減小；當胰蛋白酶添加量為4 000 U/g 時，亞鐵螯合活性最高；胃蛋白酶添加量對亞鐵螯合活性的影響不大，但在添加量為8 000 U/g時活性最高。胃蛋白酶添加量為6 000 U 時，亞鐵螯合活性最弱，這可能與酶解液中PP 的相對分子質量有關。由圖6 可知：堿性蛋白酶和胰蛋白酶添加量在6 000 U/g 時 T-AOC 最高，胃蛋白酶添加量在8 000 U/g 時T-AOC 活性最高。

圖5 3種蛋白酶添加量對亞鐵螯合活性的影響Fig.5 Effect of addition amount of three proteases on ferrous chelating activity

圖6 3種蛋白酶添加量對T-AOC的影響Fig.6 Effect of addition amount of three proteases on TAOC

綜上所述，堿性蛋白酶添加量選擇6 000 U/g，胃蛋白酶添加量選擇8 000 U/g。盡管胰蛋白酶添加量在6 000 U/g 時T-AOC 最高，但其亞鐵螯合活性顯著低于添加量為4 000 U/g 時。這一方面是由于胰蛋白酶成本較高，另一方面后續還會進行復合酶優化實驗，所以胰蛋白酶添加量暫時選擇4 000 U/g。

2.3 復合酶酶解對水解度、亞鐵螯合活性和T-AOC的影響

采用3 種酶分步酶解，酶解條件為：6 000 U/g 堿性蛋白酶酶解 3 h，4 000 U/g 胰蛋白酶酶解 2 h，8 000 U/g 胃蛋白酶酶解5 h。為探究復合酶先后酶解順序是否會對PV 酶解物的活性產生影響，測定了每一步酶解的效果和活性。復合酶酶解對水解度、亞鐵螯合活性、T-AOC 的影響如圖7—圖9 所示，其中每組酶解順序在圖中表示為由左至右，不同字母表示每步酶解結果間具有顯著差異(P＜0.05)。

圖7 復合酶酶解對水解度的影響Fig.7 Effect of compound enzymatic hydrolysis on hydrolysis degree

由圖7 可知：復合酶酶解與單一酶酶解相比，PV的水解度顯著性提高，即復合酶水解更徹底。復合酶酶解的先后順序會影響水解程度，組1 的水解度最高，其次是組2 和組6。組6 中用復合酶二步酶解(堿性蛋白酶-胰蛋白酶)和三步繼續酶解(加入胃蛋白酶)得到的水解度無顯著性差異。由圖8 可知：組1和組6 中前兩種酶的酶解產物亞鐵結合活性最高且無顯著性差異。由圖9 可知：酶解順序和組合對TAOC 有顯著性的影響；組6 中僅用前兩種酶(堿性蛋白酶-胰蛋白酶)分步酶解的水解物，得到的T-AOC最高；若三步繼續酶解(胃蛋白酶)其T-AOC 顯著下降，抗氧化活性降低。因此，二步酶解得到酶解物活性最高。

圖8 復合酶酶解對亞鐵螯合活性的影響Fig.8 Effect of complex enzyme hydrolysis on ferrous chelating activity

圖9 復合酶酶解對T-AOC的影響Fig.9 Effect of compound enzymatic hydrolysis on T-AOC

由以上結果可知，PV 的酶解優化工藝為先6 000 U/g 堿性蛋白酶酶解3 h，再4 000 U/g 胰蛋白酶酶解2 h，得到的酶解液多肽含量較多且亞鐵螯合活性和T-AOC 均較高。

2.4 卵黃高磷蛋白肽不同相對分子質量組分的活性

肽的相對分子質量大小、氨基酸組成及排列順序是影響肽結合活性的重要原因。由2～9 個氨基酸形成的寡肽比大分子蛋白質和多肽表現出更強的抗氧化性[26]。含有Ser、Lys、His、Glu、Asp、Cys 等的肽鏈更容易與鐵結合，且相對分子質量越小的多肽越容易通過細胞轉運蛋白和細胞膜內吞作用進入小腸上皮細胞[5]，小相對分子質量肽可能更適合作為鐵螯合活性肽應用于鐵補充劑。

不同相對分子質量PP 的ABTS 抗氧化活性、FRAP 抗氧化活性以及亞鐵結合量如圖10—圖12 所示，不同字母表示組間具有顯著差異(P＜0.05)。

圖10 不同相對分子質量PP的ABTS抗氧化活性Fig.10 ABTS antioxidant activity of PP with different molecular weights

圖11 不同相對分子質量PP的FRAP抗氧化活性Fig.11 FRAP antioxidant activity of PP with different molecular weights

圖12 不同相對分子質量PP的亞鐵結合量Fig.12 Ferrous binding contents of PP with different molecular weights

酶解PV 后產物活性較酶解前均有不同程度的提高，其中＜3 000 的卵黃高磷蛋白肽活性顯著高于其他多肽組分，ABTS 抗氧化能力為955.61μmol/mg，FRAP 抗氧化能力為62.30μmol/mg，亞鐵結合量為(96.14±2.86)μg/mg。對比文獻[27]的7 種小肽可以看出，小分子的PP 具有良好的抗氧化活性，同時其亞鐵結合量顯著高于綠豆肽(61.25±1.02)μg/mg[22]、乳清蛋白肽(36.42μg/mg)[28]，表明PP(相對分子質 量＜3 000)是一種潛在的鐵補充劑。

3 結論

酶解卵黃高磷蛋白的最優工藝為：先使用堿性蛋白酶在pH 10、溫度50 ℃、加酶量6 000 U/g 的條件下水解3 h，再使用胰蛋白酶在pH 8、溫度37 ℃、加酶量3 000 U/g 的條件下水解2 h。此工藝條件下水解度可達(34.69±1.50)%、亞鐵螯合活性為(87.89±0.16)%、T-AOC 為(0.160 0±0.006 2)U/mL。PP 超濾分級后，相對分子質量＜3 000 的PP 活性最好，ABTS 抗氧化能力為(955.61±79.74)μmol/mg，FRAP抗氧化能力為(62.30±3.94)μmol/mg，亞鐵結合量為(96.14±2.86)μg/mg，表明相對分子質量＜3 000 的PP 是制備鐵補充劑的良好來源。