HLA-DRB1基因多態性與早發型重度子癇前期遺傳易感性的研究

賴春池 張璐璐 孫夢雅 孫俊芳 姜紅

（青島大學附屬醫院新生兒科，山東青島 266000）

子癇前期（preeclampsia, PE）是一種常見的妊娠并發癥，重度子癇前期（severe preeclampsia,sPE）病情呈持續性進展，常導致胎兒早產和母親心血管疾病風險增加，嚴重者可伴有多器官功能衰竭，威脅母嬰生命［1-2］。大量研究表明，早發型PE 產婦圍生期不良預后、新生兒嚴重并發癥的發生率和病死率均高于晚發型［3-4］。

人類白細胞抗原（human leucocyte antigen,HLA） 是主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex, MHC） 的表達產物，HLA-DR 抗原是HLA基因系統中的重要抗原之一，決定其特異性的主要編碼基因DRB1座位具有高度多態性。既往研究表明，HLA-DRB1rs3135388 位點的多態性是多發性硬化癥的易感因素［5］；另有研究顯示，rs3135388及rs2308765位點與高血壓疾病可能存在一定相關性［6］。本研究通過對母嬰HLA-DRB1基因rs3135388與rs2308765位點所在片段進行測序，篩選單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP） 位點，探究HLADRB1基因多態性與產婦早發型sPE 遺傳易感性的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究共納入2016年12月—2017年12月期間在青島大學附屬醫院分娩的產婦及其新生兒222對，所有研究對象臨床資料完整。選取早發型sPE產婦及其新生兒102對為sPE組，同期血壓正常產婦及其新生兒120對為對照組。對照組產婦平均年齡為（31±4）歲，新生兒平均胎齡為（39.0±2.5）周。sPE 組產婦平均年齡為（33±5）歲，新生兒平均胎齡為（32.5±2.6）周。早發型sPE的診斷標準參照有關國際實踐管理建議［7］。排除標準：（1）產婦既往有原發性高血壓、腎功能不全、肝功能損傷、糖尿病和自身免疫性疾病等病史；（2）染色體異常；（3）胎兒為多胎、死胎及嚴重胎兒畸形等。本研究已獲青島大學附屬醫院倫理委員會批準（審批號：QYFY WZLL 27688），研究對象均已簽署相關知情同意書。

1.2 方法

抽取產婦清晨空腹外周肘靜脈血2 mL 置于EDTA 管中，胎兒娩出后抽取臍帶血2 mL 置于EDTA 管中。標本保存在-80°C 冰箱中備用。使用北京天根生化有限公司全血基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。取2 μL 樣品用微量紫外分光光度儀（美國Thermo 公司）對DNA 進行純度與濃度測定。HLA-DRB1基因rs3135388 和rs2308765 位點引物序列見表1，引物由美國Applied Biosystems 生物公司合成。1 μL DNA、1 μL 引物溶液（上游引物0.5 μL 和下游引物0.5 μL）、10 μL去離子水和7 μL 2×PCR Mix混勻，放入C1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad, USA）熒光定量PCR 儀中，反應條件為：95°C 5 min，94°C 45 s，57°C 1 min，30個循環。

表1 HLA-DRB1基因相關片段的引物序列

采用Sanger測序法獲得基因分型，測序結果由BioEdit Sequence Alignment Editor 直接得出，統計每個研究對象在各個位點的基因型分布。同一位點3種基因型圖像如圖1～3所示。

圖1 rs114293611 位點的Sanger 測序結果 箭頭處表明該位點一代測序結果讀取為CC。

圖2 rs114293611 位點的Sanger 測序結果 箭頭處表明該位點一代測序結果讀取為CT。

圖3 rs114293611 位點的Sanger 測序結果 箭頭處表明該位點一代測序結果讀取為TT。

1.3 統計學分析

使用SPSS 25.0 對數據進行統計學分析。計量資料以均值±標準差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗。計數資料以例數和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗或Fisher 確切概率法。對對照組基因型進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，P＞0.05 說明該數據具有群體代表性，遵循遺傳規律。采用多因素logistic 回歸模型分析等位基因頻率與sPE發生的關系。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料的比較

sPE組產婦年齡、生產次數、收縮壓和舒張壓均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；sPE組新生兒胎齡、出生體重、1 min 及5 min Apgar 評分均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，sPE組新生兒宮內窘迫和窒息的發生率顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組產婦的懷孕次數及新生兒性別的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組臨床資料的比較

2.2 HLA-DRB1基因SNP位點

在 2 個基因片段中發現 rs3135388、rs114293611 和rs142804168 3 個SNP 位點，已知的rs2308765 在本研究所選研究對象中未體現出多態性。上述3個SNP對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P＞0.05）。

2.3 兩組HLA-DRB1 基因rs114293611 位點基因型分布和等位基因頻率比較

sPE組產婦rs114293611位點的CC、CT、TT基因型分布與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），而兩組產婦在該位點的等位基因頻率的比較差異無統計學意義（P＞0.05）。在新生兒中，rs114293611 位點的基因型分布和等位基因頻率分布在兩組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3～4。

表3 兩組rs114293611位點基因型比較 ［n（%）］

表4 兩組rs114293611位點等位基因頻率比較 ［n（%）］

2.4 兩組HLA-DRB1 rs3135388 和rs142804168位點基因型分布和等位基因頻率比較

rs3135388和rs142804168位點的基因型分布和等位基因頻率在兩組產婦及新生兒之間差異均無統計學意義（P＞0.05），見表5～6。

表5 兩組rs3131388和rs142804168位點基因型比較［n（%）］

表6 兩組rs3131388和rs142804168位點等位基因頻率比較 ［n（%）］

2.5 rs114293611位點基因型母嬰配伍分析

選擇產婦與新生兒差異均有統計學意義的rs114293611 位點進行母嬰配伍，結果顯示sPE 組和對照組在基因型相容性上差異具有統計學意義（P＜0.05），見表7。

表7 兩組母嬰攜帶的rs114293611位點基因型的相容性比較 ［n（%）］

3 討論

PE的發病機制尚未完全闡明。目前公認的PE兩階段模型指出，第一階段胎盤灌注不足或異常胎盤觸發臨床表現出現，第二階段母親個體因素（環境、遺傳或行為）與之相互作用而加劇導致孕產婦綜合征［8-9］。研究表明，胎兒攜帶的HLA基因一半來自母親，一半來自父親［10］。在妊娠過程中，HLA 的產物在正常的胎兒滋養層細胞上表達，與母體子宮自然殺傷細胞上表達的殺傷IgG樣受體相互作用，維持母胎之間免疫平衡［11］。

在正常妊娠中，絨毛細胞滋養層和合胞體滋養層不表達HLAⅠ類和Ⅱ類分子，侵襲性絨毛外滋養層僅表達Ⅰ類分子（HLA-C、HLA-G、HLA-E和HLA-F）［12-13］。這一機制對于母胎免疫耐受平衡至關重要，其有效阻止了母體T 細胞針對父源性MHC 抗原的同種免疫反應，使妊娠順利繼續。一旦這種免疫平衡被打破，就可能出現母胎間免疫耐受失衡，抑制自然殺傷細胞產生參與血管生成和血管穩定的細胞因子，影響外滋養層浸潤和母體胎盤床血管重塑，從而導致滋養細胞浸潤不足、胎盤螺旋動脈生理轉化異常，引起胎盤功能失調、胎盤灌注障礙繼而發展為PE［11，14］。HLA-DR 屬HLAⅡ類，表達于專業抗原遞呈細胞上，向T細胞呈遞外源性抗原，引起特異性免疫應答。研究發現，PE 孕婦的胎盤和合體滋養層細胞來源的細胞外囊泡中HLA-DR分子異常表達，而正常妊娠的孕婦未檢測到HLA-DR分子表達［15-16］，這一發現為探索PE發病機制提供了新思路。

目前針對HLA基因多態性與PE的關系已有大量研究報道。研究顯示，PE組孕產婦HLA-DRB1*06和HLA-DRB1*07基因頻率顯著高于對照組，提示其可能是PE 發生的易感因素［17］。HLA-G基因29799440 位點的SNP 與產婦PE 的易感性存在聯系［18］。Mohammadi 等［19］研究發現，HLA-DQB1基因多態性與PE的發生有關，HLA-DQB1*0602位點的缺乏可能是PE的危險因素。另外，有研究發現，配偶間HLAⅡ類基因相容性與sPE的發生有關［20］。Zheng 等［21］發現母胎間HLA-A基因相容有利于母胎對妊娠的免疫耐受。

本研究根據HLA-DRB1基因rs3135388 位點與多發性硬化癥的發生相關文獻查詢結果，獲得其上下游引物片段［6］。本研究通過基因測序發現了新的SNP 位點rs114293611 和rs142804168。在102對sPE 組母嬰和120 對對照組母嬰之間進行Sanger測序基因分型分析中，結果顯示，rs114293611 位點基因型分布在sPE組和對照組產婦之間的差異有統計學意義；同時，在兩組新生兒間的比較中，rs114293611 位點的基因型分布差異也具有統計學意義。這表明HLA-DRB1基因rs114293611 位點的SNP 可能與早發型sPE 發生有關。此外，在sPE 組新生兒中，rs114293611 位點的T 等位基因頻率高于對照組，提示攜帶T等位基因的新生兒其母親患早發型sPE 的概率是攜帶C 等位基因的1.919 倍（OR=1.919，P＜0.05），表明HLA-DRB1rs114293611位點T等位基因可能是sPE的危險基因。其發病機制可能是該位點等位基因由C變為T時，相應氨基酸表達由色氨酸變為亮氨酸，從而影響蛋白功能表達，并進一步導致sPE的發生，但具體機制尚不清楚，有待進一步研究。然而，對于rs3135388 和rs142804168 位點而言，兩組母嬰之間的基因型分布和等位基因頻率差異均無統計學意義，尚不能認為這兩個位點的SNP與sPE的發生相關。為進一步探討HLA-DRB1基因在sPE組和對照組的母嬰傳遞上是否存在差異，我們將母嬰按rs114293611 位點的基因型分布進行配伍統計，結果顯示sPE組和對照組在基因型相容性上存在顯著差異，表明rs114293611位點在母嬰雙方基因型多態性不相容，可能與胎兒來源于父系基因導致母胎之間免疫紊亂有關，從而參與sPE的發病過程，然而具體發病機制還需要進一步研究。

綜上所述，HLA-DRB1基因rs114293611 位點SNP 可能與產婦早發型sPE 的發生相關。HLADRB1基因rs114293611 位點母嬰基因型配伍異常可能是產婦患早發型sPE的易感因素。然而，本研究的研究對象局限于中國北方女性，樣本量小。此外，sPE是一種復雜的多基因遺傳病，本研究僅選取了1個基因的3個SNP 位點，對于不同位點間是否存在相互作用未進行研究。今后還需進行擴大范圍及樣本量、涉及不同基因和多個位點的研究，進一步加深對sPE發病機制的認知，以便更好地指導臨床診斷和治療。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在任何利益沖突。