南方紅壤侵蝕區芒萁對聚乙二醇6 000模擬干旱脅迫的響應

馮柳俊,陳志強*,陳志彪,羅立津,王 健

1.福建省濕潤山地生態重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地,福建福州 350007;2.福建師范大學地理科學學院,福建福州 350007;3.福建省微生物研究所環境微生物學實驗室,福建福州 350007)

干旱脅迫是降雨量不足或土壤水分不足的結果,是限制植物生長的最主要環境脅迫之一。干旱脅迫可以誘導植物產生各種生理生化反應,極大地限制了植物的生長[1-2]。已有研究表明,干旱脅迫破壞了活性氧(ROS)的合成和清除之間的平衡,如超氧陰離子自由基(O2-·)和過氧化氫(H2O2)等。過量的ROS可破壞細胞膜的結構和功能[3],導致脂質過氧化和丙二醛(MDA)的積累,DNA和細胞蛋白質的氧化損傷,以及細胞內電解質的泄漏,相對電導率(REC)的上升[3]。植物的抗氧化防御系統促進超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的調節,降低活性氧的有害影響。SOD能夠歧化O2-·,是植物抗氧化的第一道防線;POD和CAT能夠分解H2O2,是植物抵御氧化損害的另一重要保護措施[4]。除了抗氧化防御系統外,滲透調節在植物抵抗干旱脅迫中同樣發揮著關鍵作用,脯氨酸(Pro)在其中發揮著至關重要的作用[5]。Pro的積累能夠降低細胞內的滲透勢,增加細胞液的濃度,并提高細胞從外部吸收水分的能力,保持植物細胞的膨脹壓力。因此,植物能夠通過調節自身的抗逆生理活動,增強自身對干旱脅迫環境的適應。

南方紅壤侵蝕區是我國僅次于黃土高原的第二大典型水土流失區。該區域土壤母巖主要為花崗巖,極易受到雨水飛濺和地表水流的侵蝕,尤其是在裸露的土地上;加上該區域降水時空分布不均、多暴雨、地勢起伏等地理特征,水土流失嚴重。同時,人類不合理利用自然資源,進一步加劇了生態的破壞,極大制約了該區域的社會經濟可持續發展[6]。植物在南方紅壤侵蝕區水土保持和生態修復中起著關鍵作用[7]。芒萁[Dicranopterispedata(Thunb.) Berhn.]為多年生里白科蕨類植物,常見于我國南方低山丘陵地區以及日本、越南、印度等國家,其耐酸且耐貧瘠,在生態破壞和退化過程中最后退出,而在生態恢復過程中最先進入生態系統[8]。因此,芒萁是南方紅壤侵蝕區重要的水土保持植物,其生長和覆蓋對南方紅壤侵蝕區具有重要意義。由于季節性降水分布不均且多暴雨,夏秋尤其是秋季氣溫高而蒸發量大;暴雨后紅壤易板結,滲透性減弱,降水多形成地表徑流而不補充地下水;紅壤黏粒比例高,比表面積大,牢牢吸附水分子,從而制約了植物對土壤水分的吸收;人類活動對土壤結構的破壞,紅壤蓄水能力下降[9]等,南方紅壤侵蝕區雖然降水較多,但季節性土壤干旱現象常見。前人研究表明,土壤水分是限制芒萁生長的主要因素[6]。然而,目前有關芒萁的相關研究主要集中在生長特性、培育、化感作用、生態化學計量學、生態恢復、分布、植物修復和藥用價值,鮮有關于芒萁如何抵御季節性土壤干旱脅迫的報道。因此,研究芒萁的抗旱性是利用芒萁治理南方紅壤侵蝕區水土流失和生態破壞的關鍵之一。筆者設計PEG 6 000模擬不同程度的干旱脅迫試驗,通過分析干旱脅迫下芒萁的生理特性及增強芒萁抵御干旱脅迫能力的主要因子,探討芒萁的抗旱機制,以期為利用芒萁治理南方紅壤侵蝕區水土流失和生態修復提供基礎數據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 干旱脅迫處理在福建師范大學地理科學學院采用盆栽方式種植60株生長狀況相似的芒萁幼苗(43 cm×19 cm×14 cm),每株幼苗保留15 cm的地下莖和足夠的細根,以確保存活。該試驗所用土壤來自典型的紅壤侵蝕區福建省長汀縣河田鎮。土壤經風干、過篩、充分混合后裝入盆中,土壤養分情況:碳含量為5.50 g/kg,氮含量為0.60 g/kg,磷含量為0.16 g/kg,速效磷含量為1.73 mg/kg,銨態氮含量為16.16 mg/kg,硝態氮含量為5.79 mg/kg,速效氮含量為21.95 mg/kg,pH為4.68。每個花盆裝7 kg土壤,每盆移栽1株幼苗。培養90 d后,選擇45株生長狀況較好且相似的植株,在福建省微生物研究所環境微生物實驗室的光照培養箱中進行PEG 6 000模擬干旱脅迫試驗。將芒萁轉移到透明玻璃盆(25 cm×10 cm×10 cm)中,置于光照培養箱內,晝夜光照時間和溫度設置分別為18 h/8 h和25 ℃/20 ℃。設計不同濃度的PEG 6 000(10%、20%、30%和40%)和對照(不含PEG 6 000的純水)對45株芒萁植株進行處理,每種措施3個重復。10%、20%、30%和40%濃度PEG 6 000處理組和對照組分別命名為P10、P20、P30、P40和CK。干旱脅迫后,剪下葉片樣品用液氮速凍,并儲存在冰箱-80 ℃下待測。

1.2 樣品處理試驗方法參照《植物生理學實驗指南》[10-11]。采用氮藍四唑法檢測SOD,采用愈創木酚法檢測POD,采用紫外分光光度計法檢測CAT,采用磺基水楊酸法檢測Pro,采用電導儀檢測REC,采用硫代巴比妥酸法檢測MDA。

1.3 數據分析數據由MS EXCEL 2010收集和整理;采用IBM SPSS Statistics 22.0(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)對試驗數據進行分析;采用單因素方差分析(One-way ANOVA)統計顯著性差異水平;在顯著性水平P<0.05時,使用最小顯著性差異檢驗組間平均值的差異;采用Pearson相關分析法對各指標進行相關分析,并采用主成分分析法評價不同PEG 6 000 濃度下芒萁的抗旱性;采用Origin 9.0制圖。

2 結果與分析

2.1 REC和MDA含量比較隨著PEG 6 000濃度的升高,芒萁葉片MDA和REC逐漸增大。P10、P20、P30和P40處理的MDA含量和REC均顯著高于CK(P<0.05)。P10、P20、P30和P40處理MDA含量分別是CK的1.39、1.64、1.62和1.60倍,REC分別比CK高61.93%、66.56%、69.27%和73.25%。然而,各處理間的MDA和REC均無顯著差異(圖1)。

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference among treatments(P<0.05).圖1 PEG模擬干旱脅迫下芒萁MDA含量和RECFig.1 MDA content and REC in Dicranopteris pedata subjected to drought stress induced by PEG 6 000

2.2 抗氧化酶活性比較隨著PEG 6 000濃度的升高,SOD和POD活性呈先升高后降低的趨勢。相反,CAT活性先降低后升高。與CK相比,不同濃度PEG 6 000處理顯著提高了芒萁SOD活性(P<0.05),且P20處理達到最高(1 588.11 U/g),且高于P10、P30和P40處理。P10處理POD活性[0.74 U/(g·min)]顯著高于CK(P<0.05),但P20、P30和P40處理顯著低于CK(P<0.05)。P10、P20處理CAT活性與CK無顯著差異(P<0.05);P30和P40處理顯著低于CK(P<0.05);P40處理CAT活性顯著高于P30處理(P<0.05)(圖2)。

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).圖2 PEG模擬干旱脅迫下芒萁抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidase activities of Dicranopteris pedata in response to drought stress induced by PEG 6 000

2.3 Pro含量比較隨著PEG 6000濃度的增加,芒萁葉中Pro含量先緩慢增加,然后急劇上升再下降。方差分析結果表明,P10處理Pro含量與CK無顯著差異,P20、P30和P40處理顯著高于CK和P10處理(P<0.05)。P30處理Pro濃度達到最高,為CK的4.20倍(圖3)。

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).圖3 PEG模擬干旱脅迫下芒萁脯氨酸含量Fig.3 Proline levels in Dicranopteris pedata in response to drought stress induced by PEG 6 000

2.4 相關性分析由表1可知,除SOD與POD、CAT,REC與POD、CAT、MDA無相關性外,其他生理指標間均顯著或極顯著相關(P<0.05,P<0.01)。

表1 各生理指標相關性分析

2.5 主成分分析主成分分析結果顯示,有2個主成分的特征根大于1,其中第1個主成分的特征值為3.73,第2個主成分的特征值為1.16(表2)。前2個主成分的累積貢獻率達到81.36%,因此前2個主成分可以解釋芒萁抗旱指標的大部分信息。Yi代表芒萁抗旱能力的第i個綜合指數,Zx1、Zx2、Zx3、Zx4、Zx5和Zx6分別表示SOD、POD、CAT、Pro、REC和MDA的標準值。主成分表達式如下:

表2 總方差解釋

Y1=0.38Zx1- 0.37Zx2- 0.38Zx3+0.46Zx4+0.43Zx5+0.42Zx6

(1)

Y2=0.55Zx1+0.36Zx2+0.51Zx3-0.32Zx4+0.40Zx5+0.22Zx6

(2)

將6項脅迫生理指標進行標準化,并逐一納入式(1)、(2),計算各主成分得分。然后,對主成分得分進行加權求和,得到芒萁抗旱能力的綜合評價結果。根據芒萁的抗旱性得分,從高到低依次為P30、P40、P20、P10和CK。P20、P30和P40處理芒萁的抗旱性評分分別為0.94、1.11和1.10,遠高于CK和P10處理(表3)。

表3 抗旱性綜合得分

3 討論

3.1 干旱脅迫對芒萁細胞膜的損害干旱脅迫減弱了植物的碳同化過程和光系統 Ⅱ 復合體活性,導致激發能增加和能量過剩。因此,植物體內ROS的合成和清除之間的平衡被破壞,導致ROS的積累和質膜過氧化,并增加MDA含量。此外,質膜過氧化會破壞植物細胞膜的通透性,導致細胞內電解質的泄漏。因此,MDA和REC常被用作評價細胞膜脂質損傷程度的指標[12]。該研究中,隨著PEG 6 000濃度的升高,REC和MDA逐漸升高。P10、P20、P30和P40處理的芒萁REC和MDA水平顯著高于CK。這表明干旱脅迫已經造成了芒萁體內ROS積累,質膜氧化導致MDA的大量產生。同時,干旱脅迫破壞了質膜的選擇性通透性,導致大量無機離子、氨基酸和可溶性糖等小分子的泄漏,導致REC的顯著提高。然而,不同PEG 6 000處理的REC值和MDA含量差異不大。這說明遇到干旱脅迫時,芒萁能夠調節生理活動,提高ROS清除能力,快速應對干旱脅迫。即使在極嚴重干旱脅迫下,芒萁也能有效減輕脅迫的危害,該研究中P30和P40處理REC和MDA的增量無顯著性差異便是最佳證據。有學者對沙棘[13]、煙草[14]和花生[15]的研究結果表明,隨著干旱脅迫程度的提升,植物體內MDA含量顯著增加,大麗花[16]的研究也揭示了干旱條件下MDA和REC的增加,都與該研究的結果相似。不同之處在于,盡管各處理的值都顯著高于CK組,芒萁MDA和REC的水平也不會隨著PEG 6 000濃度的升高繼續激增?？梢?與普通植物相比,芒萁具有較強的抗旱性。

3.2 芒萁的抗氧化酶活性隨著干旱脅迫的加劇,芒萁的SOD和POD活性先升高后降低。雖然SOD活性在P20處理達到最大值,然后持續下降,但P10、P20、P30和P40處理組的酶活性仍高于CK。POD活性在P10處理達到最高水平,此后顯著下降。CAT活性隨PEG 6 000濃度的增加而降低,但在濃度為40%時有所反彈。芒萁CAT活性高于POD活性。因此,在干旱脅迫下,芒萁可以誘導3種抗氧化酶的表達以清除ROS。相關分析表明,SOD與REC、SOD與MDA之間存在極顯著相關(P<0.01),表明干旱脅迫后芒萁細胞膜由于O2-·的過度積累而被氧化,于是SOD活性提高,減少了對質膜的氧化損傷。POD和CAT水平與MDA呈負相關,表明POD和CAT活性影響了芒萁對干旱脅迫的反應。當干旱脅迫程度較低時,POD和CAT共同清除H2O2。然而,在較高的干旱脅迫下,POD的合成受到限制,POD活性下降。在這種情況下,H2O2的主要清除劑為CAT。P40處理芒萁CAT活性顯著增加是有力證據。對沙棘[13]、煙草[14]、花生[15]以及大麗花[16]的研究均證明了干旱脅迫誘導ROS的積累,使植物體內SOD、POD和CAT的酶活性先升高后降低的結論。該研究中,SOD和POD活性的變化與前人研究結果相似。然而,不同的是芒萁CAT活性隨干旱強度增強呈先下降后上升趨勢。番茄幼苗CAT活性[17]和薊葉[18]的研究結果表明,CAT對干旱脅迫反應緩慢,在早期或輕度脅迫下較低,但隨著脅迫時間和脅迫水平的增加而增加,這與該研究P30和P40處理的結果相似。然而,低脅迫處理CAT活性也較高,這與前人的研究結果相矛盾。這種變化特征可能是由于干旱脅迫下,芒萁的POD活性很低,從而刺激了CAT活性以清除H2O2。因此,SOD和CAT是芒萁酶促抗氧化系統中ROS的主要清除劑。

3.3 Pro對干旱脅迫的響應滲透調節是植物適應干旱和鹽脅迫等惡劣環境的一種生理活動。植物細胞在脅迫條件下積累有機和無機物質,以降低細胞內滲透勢,試圖減少水分損失,維持膨壓,以適應干旱惡劣環境[19]。因此,滲透調節物質對植物應對干旱脅迫至關重要。Pro是一種重要的滲透調節物質,可以平衡植物細胞的滲透勢。該研究中,P10處理的Pro含量略有增加,然后急劇上升,并在P30處理達到峰值。因此,干旱脅迫顯著誘導了芒萁的滲透調節機制,降低水勢,促進水分吸收。這維持了芒萁的生理活動,如細胞膨脹和生長、光合作用和氣孔功能等,并最終緩解了干旱脅迫的危害。這與前人對冬小麥[20]、毛白楊[21]、大葉槭、臭椿、黃連木[22]的研究結果相似。然而,P40處理Pro水平下降,這是由于過度干旱脅迫影響了關鍵酶二氫吡咯-5-羧酸合酶,導致Pro含量下降。前人研究表明,植物在過度干旱脅迫后合成Pro的能力降低,導致Pro水平下降[23]。如水稻抗旱性研究報道了過度應激后Pro含量的下降[24]。值得注意的是,P30處理的Pro含量達到最大值,而CAT活性也在P30處理開始增加。因此,低干旱脅迫下CAT活性的降低與Pro的積累有關,Pro可以減少ROS,尤其是H2O2,防止質膜過氧化,此時無需高活性CAT清除ROS。此外,Pro的變化趨勢與主成分抗旱性評價得分的排序相似。主成分分析結果表明,芒萁的抗旱性得分隨著PEG 6 000濃度的增加而增加,在PEG 6 000濃度為30%時達到峰值,在PEG 6 000濃度為40%時下降,呈現單峰趨勢。Pro同樣顯示出單峰趨勢,在30% PEG 6 000 時達到峰值,隨后下降。因此,芒萁的強抗旱性與Pro有密切關系。Pro與其他5個指標均存在顯著的相關關系也證明了該結論。這一結果表明,在干旱脅迫后,芒萁合成并積累Pro,并與抗氧化酶SOD、POD和CAT協同作用,增強抗旱性。因此,Pro的合成和積累對芒萁干旱脅迫的響應中極為重要。

4 結論

該研究揭示了南方紅壤侵蝕區芒萁抵御干旱脅迫的生理機制。芒萁在干旱缺水的惡劣環境中的生存與其抗逆生理特性有關,包括抗氧化酶活性的快速誘導和滲透調節物質的積累。然而,當干旱脅迫較為嚴重時,抗旱機制受到影響,抗旱能力減弱。其中,抗氧化酶SOD和CAT以及滲透調節因子Pro是芒萁抵抗干旱脅迫的關鍵生理因子。因此,作為一種優良的水土保持植物,芒萁能夠適應季節性土壤干旱,是其能夠在我國南方紅壤侵蝕區生態修復和水土保持方面發揮重要作用的重要原因。