骨髓增生異常綜合征基因突變特征的臨床分析△

安萬花，郭淑利，肖蓬莉，王萬里，田煥煥，彭靚，楊璞，毛慧云，王慧睿#

1新鄉醫學院研究生院，河南 新鄉 453003

2鄭州大學附屬洛陽市中心醫院血液內科，河南 洛陽 471009

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015 年1 月至2020 年12 月于鄭州大學附屬洛陽市中心醫院進行二代測序檢測的MDS 患者的病歷資料。納入標準：符合MDS 診斷標準[4]；進行二代測序檢測。排除標準：病歷資料不完整。根據納入、排除標準，共納入43 例MDS 患者，其中，男26 例，女17 例；年齡55～71 歲，中位年齡65歲；外周血白細胞計數（0.53～19.78）×109/L，中位白細胞計數2.80×109/L；血紅蛋白（31～114）g/L，中位血紅蛋白68 g/L；中性粒細胞計數（0.15～39.60）×109/L，中位中性粒細胞計數1.30×109/L；血小板計數（6～216）×109/L，中位血小板計數43×109/L；MDS 的診斷與分型[4]：MDS 伴單系病態造血（MDS-SLD）4例，MDS 伴多系病態造血（MDS-MLD）10 例，MDS伴環形鐵粒幼細胞伴單系病態造血（MDS-RSSLD）2 例，MDS 伴孤立5q（MDS-5q-）1 例，MDS 伴原始細胞增多Ⅰ型（MDS-EB-1）20 例，MDS 伴原始細胞增多Ⅱ型（MDS-EB-2）5 例，MDS 不能分類型（MDS-U）1 例。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 染色體核型分析

收集骨髓細胞，經過24 h 培養后制片，采用常規R 顯帶技術，根據參考文獻[8]進行染色體核型描述。

1.3 二代測序靶向檢測基因突變

提取骨髓液（2～5 ml）中的gDNA，通過多重聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增技術，一次性抓取待檢測的所有基因（髓系血液疾病34 種高頻突變基因），并將構建好的文庫用illumina 平臺NextSeq550 測序儀進行檢測。本檢測涵蓋了所檢測基因編碼區及附近內含子區的點突變、小片段插入和缺失型突變，依據突變基因在血液病中的突變類型和功能，并參照指南和文獻報道判定檢測結果。測序由康圣環球（北京海思特醫學檢驗實驗室）完成。

1.4 治療方案

結合IPSS-R 預后分層、年齡、依從性等進行綜合評價，選擇治療方案。21 例較低危組患者以支持治療為主，包括成分輸血、造血生長因子及免疫調節劑等；20 例較高危組患者多采用去甲基化藥物、預激方案等化療及異基因造血干細胞移植；2例患者定期門診復查，未行相關治療。

1.5 隨訪

通過門診、住院及電話進行隨訪，隨訪截止時間為2020 年12 月31 日，隨訪內容主要為生存狀態、死亡時間及原因。總生存期（overall survival，OS）：從疾病確診日期到死亡或末次隨訪日期。

1.6 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析并采用Graphpad Prism9.0 及Circos V0.69 軟件繪制統計圖，不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因突變特征分析

本研究共檢測到33 種基因突變，每例患者的突變基因個數為0～8 個，中位突變基因個數為2個。40 例（93.02%）患者攜帶至少1 個基因突變，其中11 例（25.58%）患者攜帶1 個基因突變，29 例（67.44%）患者攜帶≥2 個基因突變；在攜帶1 個基因突變的患者中，腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）突變率最高，占18.18%。

檢出的異常基因中，檢出頻率＞5%的基因共16 個，其中突變例數較多的基因有U2 小核RNA 輔助因子1（U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1，U2AF1）、ASXL 轉錄調控因子1（ASXL transcriptional regulator 1，ASXL1）、DNA 甲基轉移酶3α（DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A）、甲基胞嘧啶雙加氧酶2（tet methylcytosine dioxygenase 2，TET2）、RUNX 家族轉錄因子1（RUNX family transcription factor 1，RUNX1）（圖1A）；突變負荷（即變異豐度）中位數較高的基因有E1A 結合蛋白p300（E1A binding protein p300，EP300）（49.1%）、CREB 結合蛋白（CREB binding protein，CREBBP）（47.6%）、ASXL1（47.1%）、TP53（45.0%）、U2AF1（42.7%）、剪接因子3b 亞基1（splicing factor 3b subunit 1，SF3B1）（41.0%）（圖1B）。

圖1 MDS患者檢出基因的突變例數及突變負荷

依據MDS 患者檢出突變基因的功能進行分類，突變頻率從高到低依次為表觀遺傳相關基因[占62.79%（27/43），包括ASXL1、DNMT3A、DNMT3B、TET2、SET結合蛋白1（SET binding protein 1，SETBP1）、BCL6 輔抑制物（BCL6 corepressor，BCOR）、異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、IDH2、賴氨酸甲基轉移酶2D（lysine methyltransferase 2D，KMT2D）、zeste 2 多梳抑制復合體2 亞基增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2）和WT1]、剪接子相關基因[占46.51%（20/43），包括U2AF1、SF3B1、富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2（serine and arginine rich splicing factor 2，SRSF2）和鋅指CCCH 型RNA 結合基序和富含絲氨酸/精氨酸（zinc finger CCCH-type,RNA binding motif and serine/arginine rich 2，ZRSR2）]、轉錄調節相關基因[占37.21%（16/43），包括RUNX1、PHD手指蛋白6（PHD finger protein 6，PHF6）、CREBBP、cut 樣同源盒1（cut like homeobox 1，CUX1）、CCAAT 增強子結合蛋白（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPA）、GATA 結合蛋白2（GATA binding protein 2，GATA2）、親嗜性病毒整合位點1（ecotropic viral integrationsite 1，EVI1）和ETV6]、信號轉導相關基因[占30.23%（13/43），包括蛋白酪氨酸磷酸酶非受體11 型（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11，PTPN11）、Janus 激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、NRAS、Kirsten 鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、KIT、CBL]、細胞增殖或凋亡相關基因[占18.60%（8/43），包括TP53和核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）]和其他功能[占11.63%（5/43），包括STAG2和EP300]（表1）。其中，表觀遺傳基因組（n=27）患者基因突變個數為3.00（2.00，5.00）個，明顯多于非表觀遺傳基因組（n=16）的1.00（1.00，2.80）個，差異有統計學意義（Z=-2.922，P=0.003）；剪接子相關基因U2AF1為本研究檢出率最高的突變基因，U2AF1突變組（n=10）患者基因突變個數為4.00（2.00，5.00）個，多于非突變組（n=33）的2.00（1.00，3.00）個，差異有統計學意義（Z=-2.288，P=0.022）。

根據坑槽大小，結合實際情況選用人工夯實或小型機具壓實。坑槽壓實后應在表面均勻撒布一層細砂，使細砂填充表面孔隙，減少路表水的下滲，最后將修補完成的坑槽清潔干凈。坑槽修補完成后，修補表面應呈中間略高于四周的弧形，以避免修補表面在行車荷載的二次碾壓下形成凹槽。

表1 43 例MDS 患者檢出33 種基因的突變情況

2.2 突變基因關聯性分析

67.44%（29/43）攜帶≥2 個突變基因的患者，基因伴隨突變發生在單一功能組內的比例（55.20%）高于發生在不同功能組內（44.80%）。本研究突變頻率較高的基因中，U2AF1、ASXL1與DNMT3A往往與其他突變伴隨出現。

表觀遺傳相關基因突變分析：表觀遺傳相關基因突變數占總突變數的37.07%（43/116）（表1），該類基因間伴隨突變包括：ASXL1-BCOR、ASXL1-SETBP1、ASXL1-DNMT3A、ASXL1-EZH2、ASXL1-TET2、ASXL1-IDH1、BCOR-EZH2、IDH1-WT1、IDH2-TET2、DNMT3A-TET2、DNMT3A-IDH1、SETBP1-DNMT3A、SETBP1-TET2、SETBP1-IDH1。

非表觀遺傳相關基因突變分析：U2AF1與NRAS、CREBBP伴隨突變的比例較高。剪接子相關基因突變常與轉錄調節相關基因突變常伴隨出現，信號轉導相關基因突變與本功能組內基因間伴隨突變較常見。

2.3 基因突變個數與MDS 亞型的關系

不同亞型MDS 中，基因突變個數最多的是MDS-U，共8 個（圖2A）。MDS-MLD、MDS-SLD、MDS-EB-1、MDS-EB-2 和MDS-U 中，攜帶3 個以上突變比例逐漸升高（圖2B）。在各亞型中，伴有0個基因突變的比例分別為MDS-MLD 10%，MDSSLD 25%，MDS-EB-2 20%；伴有1 個基因突變的比例分別為MDS-MLD 30%，MDS-EB-1 30%，MDSEB-2 20%，MDS-RS-SLD 50%；伴有2 個基因突變的比例分別為MDS-MLD 40%，MDS-SLD 25%，MDS-EB-1 15%，MDS-RS-SLD 50%；伴有3 個基因突變的比例分別為MDS-MLD 10%，MDS-SLD 25%，MDS-EB-1 25%，MDS-EB-2 20%，MDS-5q-100%；伴有3 個以上基因突變的比例分別為MDSMLD 10%，MDS-SLD 25%，MDS-EB-1 30%，MDSEB-2 40%，MDS-U 100%（圖2B）。

圖2 基因突變個數和構成比與MDS亞型的關系

2.4 基因突變與IPSS-R 預后分層的關系

高危+極高危組MDS 患者基因突變個數和染色體異常數目均多于低危+中危組患者，NRAS突變率高于低危+中危組患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）（表2）。高危+極高危組6 例NRAS突變患者截至末次隨訪時，死亡5 例（83.33%）。

表2 低危+中危組與高危+極高危組MDS患者基因突變情況的比較

2.5 基因突變與染色體核型的關系

本研究中，異常核型患者基因突變比例為93.75%（15/16），與正常核型患者基因突變比例的92.59%（25/27）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。其中5 例SETBP1突變均發生在異常核型患者中，截至末次隨訪，死亡4 例（80.00%）。

2.6 基因突變與年齡的關系

根據患者年齡分組，年齡≥70 歲MDS 患者SF3B1突變率為26.67%（4/15），高于＜70 歲患者的0%（0/28），差異有統計學意義（P=0.011）。SF3B1突變患者中有1 例患者OS 最長達98 個月，截至隨訪結束之日仍生存。

3 討論

MDS 的發生、發展是一個多步驟、復雜的病理過程，其發病機制目前尚未完全闡明。當前，二代測序技術的發展迅速，本研究旨在探討MDS 基因突變特征與臨床特征的關系。本研究對43 例MDS 患者進行分析發現，U2AF1突變頻率最高，與李冰等[9]報道最高突變基因一致，并發現U2AF1突變組基因突變個數多于非突變組。Hosono[10]報道MDS 患者突變頻率最高的基因為SF3B1。Tefferi等[11]通過對179 例MDS 患者的二代測序發現，ASXL1的突變頻率最高。以上國內外研究的差異可能是由地理位置、生活習慣和環境等因素引起。

本研究共檢測出MDS 突變基因33 種，根據功能不同，主要涉及表觀遺傳學、轉錄調節、剪接因子、信號轉導和細胞凋亡增殖等相關基因[9-10,12]，其中最常見的突變基因為表觀遺傳相關基因，與文獻報道一致[9]。除表觀遺傳相關基因外，剪接子相關基因突變常與轉錄調節相關基因突變伴隨出現，提示剪接子相關基因突變與轉錄調節相關基因突變之間可能有協同促進MDS 發生的作用。本研究突變頻率較高的基因中，ASXL1往往與其他突變伴隨出現，與既往報道一致[13]。本研究中1例老年男性患者存在ASXL1、SETBP1、NRAS、KRAS、IDH1、PTPN11、DNMT3A、CBL伴隨突變，確診14 個月后死亡。與文獻報道的ASXL1和SETBP1共同突變可驅動MDS 轉化為急性髓系白血病相符[14]，提示聯合基因突變患者的預后可能較差。

本研究中，93.02%的患者攜帶至少1 個基因突變，符合既往研究報道[1-3]。不同亞型MDS 中，基因突變個數最多的是MDS-U，共8 個。MDS-MLD、MDS-SLD、MDS-EB-1、MDS-EB-2 和MDS-U 中，攜帶3 個以上基因突變比例逐漸升高，與以往研究結果相近[15]。高危+極高危組有6 例NRAS突變患者，截至末次隨訪，死亡5 例（83.33%）。有文獻報道，NRAS突變與較短的OS 相關，且向急性髓系白血病轉化的風險較高[16]。結合本研究與既往文獻分析，提示NRAS突變的不良預后可能由于其更多的骨髓原始細胞所致。

基因突變與染色體核型的相關分析中發現，SETBP1突變均發生在異常核型患者中，截至末次隨訪時間，死亡4 例（80.00%）。既往多項研究表明，表觀遺傳相關基因SETBP1在髓系腫瘤中發揮促癌基因的作用，提示SETBP1突變為MDS 患者OS 的獨立危險因素，可促進MDS 向急性髓系白血病轉化[11,17-19]。本研究與以上國內外研究報道一致，均表明伴有該基因突變的患者預后不良。

本研究4 例SF3B1突變患者均為老年人，有研究報道，SF3B1突變的MDS 患者發病年齡明顯大于SF3B1未突變的患者[20-21]。本研究中，截至末次隨訪，1 例SF3B1突變患者OS 最長達98 個月，仍生存，符合Nazha 等[22]分析了508 例MDS 患者的臨床數據顯示SF3B1突變可能延長患者的OS。相關研究亦顯示，SF3B1突變是一個有利預后的因素，可作為一種獨特的疾病亞型，向急性髓系白血病轉化的風險降低[23]。

綜上所述，MDS 患者的基因突變可以通過二代測序在大多數（＞90%）患者中檢測到，67.44%的患者存在基因之間的伴隨突變。MDS 相關基因突變特征可能與疾病亞型、IPSS-R 預后分層、染色體核型和患者年齡等臨床特征有關。二代測序為MDS 患者預后評估和療效預測提供依據，可考慮納入MDS IPSS-R。