藥品微生物限度檢查真菌污染鑒定溯源*

黃 結(jié)，李雪玲，朱 斌，甘永琦，王 濤，零文超

2020年版《中國藥典（四部）》［1］指導(dǎo)原則9203中規(guī)定，當(dāng)藥品微生物檢驗結(jié)果不符合藥典各品種項下要求或另外建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)調(diào)查原因。《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）第224 條規(guī)定，實驗室檢驗超標(biāo)結(jié)果（OOS）需按操作規(guī)程進行完整地調(diào)查。進行OOS調(diào)查，找到微生物污染的根本原因，可為準(zhǔn)確判定超標(biāo)結(jié)果是否真實有效提供依據(jù)，利于檢測機構(gòu)或企業(yè)有針對性地采取有效糾正和預(yù)防措施，避免同類事件再次發(fā)生，提高實驗室管理質(zhì)量，同時為檢驗結(jié)果和產(chǎn)品風(fēng)險作出準(zhǔn)確判斷提供支撐［2］。微生物鑒定和溯源分析，對于確定微生物污染原因具有重要意義［3］。但截至目前，微生物溯源分型技術(shù)為無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同分型方法各有其局限性［4］，其中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS 序列）分析技術(shù)具有高通量、高效率、高準(zhǔn)確率等特點，屬基因型鑒定技術(shù)，可實現(xiàn)微生物的鑒定、分類、溯源及污染調(diào)查分析［5］。本研究中以ITS 序列分析技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術(shù)，對實驗室一次樣品真菌污染事件與OOS 調(diào)查采集到的環(huán)境相似菌株進行鑒定和溯源分析，為生產(chǎn)企業(yè)和檢測機構(gòu)樣品污染真菌的溯源和控制提供依據(jù)和方法。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

GR110DR 型高壓蒸汽滅菌鍋（美國Zealway 公司）；AC2-6S1/A2級雙人操作生物安全柜（新加坡Esco公司）；BD720 型恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder 公司）；MM400 型冷凍研磨儀（德國Retsch 公司）；JY300C 型電泳儀、JY -SPFT 型水平電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；5200 系列凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；U410 - 86 型超低溫冰箱（英國New Brunswick 公司）；DM6000B型顯微鏡（德國Leica公司）；Microflex LT型基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀（德國Bruker Daltonik GmbH公司）；Universal 320R型高速冷凍離心機（德國Hettich公司）；Mastercyler gradient PCR儀（德國Eppendorf公司）。

1.2 試劑

pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液（批號為210310）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號為201112），均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基（德國Merck Millipore 公司，批號為VM906938）；乙腈、三氟乙酸（色譜純）、MALDI-TOFMS 基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)肽蛋白（德國Bruker Daltonik GmbH 公司）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物（北京天根生化科技有限公司）；水為無菌水。

1.3 菌株來源

從藥品微生物限度檢查霉菌和酵母菌總數(shù)項目超標(biāo)1次案例中，分離純化的樣品污染的主要霉菌標(biāo)記為YP01 - YP04，OOS 調(diào)查采集到的相似環(huán)境菌標(biāo)記為HJ01-HJ08。菌株來源見表1。

表1 菌株來源Tab.1 Origin of strains

1.4 菌株鑒定方法

傳統(tǒng)形態(tài)觀察法：無菌操作下接種各菌株于SDA平板上，23 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落的顏色、形狀、大小、表面狀況、質(zhì)地等形態(tài)特征，拍照并記錄。取適量培養(yǎng)物，封固液（乳酸品紅）制片，置顯微鏡油鏡下直接觀察。

ITS 序列分析法：采用北京天根生化科技有限公司DP350 天根植物基因組DNA 提取試劑盒（植物、真菌DNA提取均可使用）進行真菌DNA 的提取，具體操作參考說明書。PCR 擴增引物序列：ITS1，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3' ；ITS4，5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3'。擴增體系為25 μL，其中10 × Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，引物（10 μmol/ L）1.5 μL，dNTP（10 mmol/ L）2 μL，Taq 酶（5 U/ μL）0.125 μL，DNA 5 μL，ddH2O 13.875 μL。擴增程序為，98 ℃，5 min；98 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃60 s（共35 個循環(huán)）；72 ℃10 min。得到的PCR 產(chǎn)物一部分用于凝膠電泳檢查，一部分進行ITS 序列測序，測序委托北京樂八科技有限公司完成。利用NCBI BLAST 工具將得到的菌株序列與Gen-Bank 基因庫中已知菌的序列進行比對，得到菌株鑒定結(jié)果。

1.4.3 MALDI - TOF - MS 鑒定法

采用甲酸乙腈提取法制備霉菌樣品［6］。取培養(yǎng)后菌株的菌絲體約10 mg，置離心管中，加入300 μL水，混勻，再加無水乙醇900 μL，混勻，13 000 r/ min 離心2 min，棄去上清液，室溫靜置2 min；待菌體完全干燥，加入70%甲酸溶液50 μL，混勻，室溫靜置2 min，加入乙腈50 μL，混勻，13 000 r/min離心2 min；取1 μL上清液滴加至MALDI 靶板上，室溫晾干，加1 μL HCCA 基質(zhì)溶液，覆蓋晾干，將靶板置入MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀中進行菌株鑒定。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)與顯微形態(tài)

將樣品檢出的霉菌和采集到的環(huán)境霉菌同法培養(yǎng)后，取菌落形態(tài)相似的菌株一并進行鑒定溯源。樣品菌YP01 的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)見圖1，各菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)描述見表2。

A. 菌落形態(tài) B. 顯微形態(tài)圖1 菌株（YP01）的菌落形態(tài)與顯微形態(tài)A.Colony morphology B.Microscopic morphologyFig.1 Colony morphology and microscopic morphology of the strain（YP01）

表2 各菌株鑒定結(jié)果Tab.2 Results of strain identification

2.2 ITS 序列鑒定

凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，12 個菌株的PCR 產(chǎn)物均在500～600 bp 之間得到清晰、完整的電泳條帶，詳見圖2。12個菌株的PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果最大鑒定率均大于99%（基因測序鑒定結(jié)果鑒定率大于98.7%，即與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列同種［7-8］），表明結(jié)果可靠。ITS 序列鑒定結(jié)果見表2。

圖2 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.2 Results of gel electrophoresis detection of PCR products

2.3 MALDI-TOF-MS 鑒定

HJ02 - HJ08 的鑒定分值均大于2.0 分，表示鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，可鑒定出具體菌名。YP01-YP04 和HJ01 未給出具體鑒定結(jié)果，所測物質(zhì)蛋白分子量主要集中在2 000～18 000 Da 范圍內(nèi)（質(zhì)譜圖見圖3），在橫坐標(biāo)相同的點上有峰強度增強，各菌株主要質(zhì)譜峰重疊度高。

圖3 菌株的疊加質(zhì)譜圖Fig.3 Superimposed mass spectrograms of strains

2.4 同源性分析

利用MEGA 5.0 軟件對12 個菌株的序列進行比對，采用Neighborhood - Joining 法構(gòu)建有根系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。樣品菌YP01-YP04 和環(huán)境菌HJ01 的基因水平無明顯差異，能聚為一類，存在同源性。

圖4 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains

3 討論

在同一天實驗中出現(xiàn)多批樣品真菌結(jié)果超標(biāo)，從超標(biāo)樣品SDA 平板上觀察發(fā)現(xiàn)真菌形態(tài)非常相似，懷疑樣品受到了環(huán)境菌污染，觸發(fā)了實驗室OOS 調(diào)查。實驗員從人、機、料、法、環(huán)5個方面回顧整個檢驗流程，逐一排查原因，并使用SDA 接觸皿進行潔凈環(huán)境多地點采集和實驗用料的微生物檢測，共找到了8株與超標(biāo)樣品相似的真菌。鑒定及同源性分析顯示，得出樣品檢出菌YP01 - YP04 和環(huán)境菌HJ01 存在同源性，即樣品污染菌來自pH 7.0 氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，是實驗用“料”出現(xiàn)問題。配制員再次針對同批次的實驗用料進行全面排查和回顧，其受污染的可能原因如下。一是使用的稀釋液經(jīng)壓力蒸汽滅菌后存在有滅菌容器瓶的膠塞松動或容器傾倒現(xiàn)象，配制員操作是扭緊膠塞或扶正容器，繼續(xù)放入實驗室，稀釋液存在微生物污染風(fēng)險；二是滅菌后的實驗材料未及時放入潔凈環(huán)境暫存室。針對以上原因?qū)嵤┤缦录m正預(yù)防措施：1）重新?lián)Q購一批匹配的膠塞；2）發(fā)現(xiàn)滅菌后容器膠塞有松動或容器傾倒，應(yīng)立即丟棄；3）及時將滅菌物品移入潔凈環(huán)境暫存室。經(jīng)過一段時間的驗證再無類似事件發(fā)生。

局限曲霉菌是人及動物曲霉病的病原菌，廣泛分布于土壤、食品和發(fā)霉紙盒及織物等，可通過呼吸道和血液傳播，可侵犯皮膚、黏膜、眼腦、耳鼻、肺部、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致敗血癥。溫暖潮濕環(huán)境利于其生長和繁殖，可產(chǎn)生大量的分生孢子，易于煙霧化存在于空氣中，可通過實驗人員、物品傳遞和空氣流動污染實驗室潔凈區(qū)。針對實驗室潔凈區(qū)霉菌污染高風(fēng)險點，加強清潔滅菌，定期采用過氧化氫殺孢子劑等進行徹底消殺，可確保潔凈區(qū)潔凈。

MALDI-TOF-MS 鑒定發(fā)現(xiàn)，局限曲霉菌的菌株蛋白質(zhì)圖譜較佳，但MALDI-TOF-MS 的數(shù)據(jù)庫中缺少局限曲霉，未得到鑒定結(jié)果。同源性分析發(fā)現(xiàn)，YP01-YP04 和HJ01 的ITS 序列能聚為最小分支，質(zhì)譜峰重疊度高，菌落形態(tài)和顯微形態(tài)相同，因此真菌YP01 -YP04和HJ01親緣關(guān)系非常接近。

ITS 序列鑒定分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鑒定菌株序列與基因庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對時會至少出現(xiàn)2 個匹配結(jié)果且最大鑒定率均為100%的情況，因此本研究中還結(jié)合了形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，以得到準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果［9］。霉菌的ITS 序列在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度保守性，是微生物核酸測序鑒定分類中得到廣泛應(yīng)用的DNA 特征性核酸序列之一，方法易于標(biāo)準(zhǔn)化［10-11］。這也是本研究中采用ITS 序列分析技術(shù)進行霉菌污染溯源的原因，且該方法簡單、快速、重復(fù)性好。