中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌量化風險評估研究*

宋 琳，白秀秀，李 輝

（1. 陜西省藥品和疫苗檢查中心咸陽分中心，陜西咸陽 712000； 2. 西安漢豐藥業(yè)有限責任公司，陜西西安710050； 3. 陜西盛德泰林生物安全技術檢測有限公司，陜西西安 710077）

微生物污染是中藥飲片質量安全的不確定性風險，部分飲片因無須再做進一步的煎煮處理即使用［1］，需特別關注其用藥安全。2015 年版《中國藥典》首次在直接口服和泡服類飲片的質量控制指標中納入耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌，2020 年版《中國藥典》增加了需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)和大腸埃希菌指標［2］，進一步加強了對2種飲片的微生物限度要求。耐膽鹽革蘭陰性菌指標泛指能在規(guī)定培養(yǎng)條件下在結晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基上生長的微生物，包括腸桿菌屬、產氣單胞菌屬、假單胞菌屬等［3］，是反映中藥飲片衛(wèi)生狀況的重要指標，該指標兼具描述污染種類和數(shù)量的特點，是進行風險評估的理想指標。據(jù)報道，中藥飲片主要污染微生物情況復雜且分布不均勻，但總體細菌污染率較高，其中耐膽鹽革蘭陰性菌污染問題較突出［1，4-8］。從數(shù)量上看，污染的耐膽鹽革蘭陰性菌平均對數(shù)值為2～3［4］，從種類上看，主要是革蘭陰性菌。甘永琦等［5］結合基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和高通量測序技術分析了通草等9 個中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染情況，發(fā)現(xiàn)耐膽鹽革蘭陰性菌分布不均，主要是腸桿菌屬、泛菌屬及其他屬微生物。本研究中利用風險評估工具量化中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的風險，同時考慮污染種類、數(shù)量等因素，為中藥飲片的微生物風險管理提供新思路?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 中藥飲片數(shù)據(jù)收集

以“中藥飲片”“飲片”“中藥材”和“微生物”“耐膽鹽革蘭陰性菌”等為關鍵詞，檢索中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫2012年1 月1 日至2021 年12 月31 日發(fā)表的相關文獻，最終納入文獻15 篇。篩選和整理文獻數(shù)據(jù)，剔除信息不完整、表述模糊的數(shù)據(jù)，對直接以測定數(shù)值報道的數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉換。為便于統(tǒng)計，以N表示耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)，N＜10 cfu/ g 時行對數(shù)轉換后均以0.5 計；N＞104cfu/g 且無具體測定值時以4.5 計；當未以N描述時，按N＞103cfu/g和N＞104cfu/g統(tǒng)計飲片所占比例；對于可計算耐膽鹽革蘭陰性菌平均值的，轉化為平均值進行數(shù)據(jù)分析。

1.2 量化風險評估模型建立

多種風險評估工具可用于量化風險評估，根據(jù)人用藥品注冊技術國際協(xié)調會議（ICH）Q9風險管理的基本原則對中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的安全風險進行識別、分析和評價，建立失效模式和效應分析模型（FMEA）識別失效模式。FMEA 主要考慮3 個方面的因素，耐膽鹽革蘭陰性菌的可檢測性（DET）、檢出頻率（即發(fā)生的可能性，OCC），以及類群特征和是否為直接口服和泡服類飲片確定危害嚴重性（SEV），以評估風險。按以上規(guī)則形成中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌風險評估模型，詳見表1。

表1 基于FMEA的中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌風險評估模型Tab.1 Risk assessment model for bile salt-resistant Gram-negative bacteria in TCM decoction pieces based on FMEA

1.3 風險等級判定標準

以風險指數(shù)（RPN）定量描述風險大小，RPN =SEV ×OCC×DET。每個因素根據(jù)程度不同分為3 個等級分別賦值。通過評估3 個因素的綜合影響，按RPN 值的大小判定風險等級，1～4為低風險，6～12為中風險，18～27 為高風險。考慮中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌組成和分布的復雜性，為彌補風險評估系統(tǒng)的不足，需對風險指數(shù)評價系統(tǒng)進行修正。規(guī)定當SEV 為1 或3 時，無論RPN 為何值，均認為是低或高風險。高風險需重點關注，并考慮微生物控制措施降低風險，并監(jiān)測剩余風險；中風險需進行風險收益分析，確定是否采取適當措施降低風險等級；低風險無須采取風險應對措施，為可接受狀態(tài)。

2 結果與分析

確定參與量化風險評估的中藥飲片品種共53 個、760 批次。中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染狀況及量化風險評估結果見表2。其中N1及N2分別代表N＞103cfu/g菌及N＞104cfu/ g 菌；某些品種因文獻數(shù)據(jù)分析結果差異大，故標以不同數(shù)字分開統(tǒng)計?？梢?，穿心蓮、兩頭尖、部分枸杞和部分麥冬飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染風險高，占6.25%（4/64）；紅花、夏枯草和部分菊花飲片耐膽鹽革蘭陰性菌污染風險中等，占4.69%（3/64），其余中藥飲片的耐膽鹽革蘭陰性菌污染風險低，占89.06%（57/64）。

枸杞等10個品種中藥飲片調查結果的風險評估結果見表3（其中不同組別與表2 中飲片數(shù)字相對應），其中7個品種完全一致，說明中藥飲片的耐膽鹽革蘭陰性菌污染狀況雖不同，但其風險等級可能相同，同時也說明建立的量化風險評估方法可行性較好。枸杞、麥冬和菊花飲片的風險評估結果不一致，說明此類直接口服和泡服的飲片耐膽鹽革蘭陰性菌分布種類和數(shù)量分布不均，也說明建立的方法尚存在一定局限性；同時存在高、中風險和低風險，說明采取措施進行適當微生物控制完全可降至低風險等級，實現(xiàn)中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌指標的控制。

表3 10種中藥飲片的風險評估結果分析Tab.3 Results of risk assessment of ten TCM decoction pieces

中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的污染途徑及傳遞過程分析見圖1。降低污染風險的措施，主要為需關注源頭和過程的引入及過程中的生長繁殖，其中炮制、加工、貯藏和流通是降低風險的關鍵過程。

圖1 中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的來源與傳遞Fig.1 Source and transmission of bile salt-resistant Gram-negative bacteria in TCM decoction pieces

3 討論

2020 年版《中國藥典》對直接口服和泡服飲片提出了耐膽鹽革蘭陰性菌的控制要求，對煎煮類飲片未作要求，但從中藥飲片微生物風險評估角度看，應對中藥飲片總體進行全面評估。盡管中藥飲片煎煮后其耐膽鹽革蘭陰性菌會減少甚至被殺滅，但當生物負載過高時其毒素殘留會增加且微生物不能被完全殺滅的可能性增加，同樣也會帶來安全風險。因此，本研究中在風險評估時適度參考了2020年版《中國藥典（四部）》通則1107 非無菌藥品微生物限度標準中對直接口服和泡服的中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的要求，從嚴重性出發(fā)設定了煎煮類飲片風險等級的參考值。

近年來文獻積累的數(shù)據(jù)為評估中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的安全風險提供了可能。耐膽鹽革蘭陰性菌對中藥飲片造成風險嚴重性的確定較復雜，考慮合規(guī)性，致病性和給藥途徑尚無法全面反映安全風險，可能會影響評估結果的準確性。如從飲片用量角度分析，目前中藥飲片的用量普遍較大，陳玉歡等［26］對12 家中醫(yī)院的飲片處方量調查顯示，中藥飲片處方平均劑量為129.60～245.00 g，平均藥味數(shù)為12～18 味，使實際中中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌風險更復雜，增加了全面風險評估的難度。近年來，以質量與安全為核心的質量等級評價模式構建正在逐漸形成［27］，而其關鍵質量指標的選擇考慮仍主要是理化指標，對微生物方面的考慮不足，量化風險評估模型的建立是對現(xiàn)有外源性有害物風險評估模型的補充。而量化評估方法作為中藥飲片微生物風險評估的新模式，為采取措施降低風險與合理控制創(chuàng)造了條件。

中藥飲片過高的生物負載可使耐膽鹽革蘭陰性菌的部分微生物逃逸煎煮過程的殺滅，從而殘留在藥液中，如該藥液未及時用完，可能會在藥液中生長繁殖，造成“耐熱菌”的假象。根據(jù)本研究中量化風險評估結果，可以有針對性地對某些易導致耐膽鹽革蘭陰性菌污染的品種及過程進行控制，降低生物負載。耐膽鹽革蘭陰性菌的生長繁殖通常需要較高的水分，在炮制、貯藏、流通等環(huán)節(jié)采取措施控制水分，是防止微生物生長繁殖的重要途徑。在炮制環(huán)節(jié)關注中藥材及飲片自身的吸濕性能［28］，李瓊瓊等［6］的調查顯示，經凈制、干燥等簡單炮制工藝的飲片中耐膽鹽革蘭陰性菌檢出率遠高于炮制工藝包含熱處理的飲片。規(guī)范化流通和貯藏是降低耐膽鹽革蘭陰性菌生長繁殖的關鍵環(huán)節(jié)之一［29］。如山楂、桔梗、補骨脂、麻黃等藥材有返潮或吸潮現(xiàn)象，水分含量超標較嚴重［30］，環(huán)境及預防措施不到位導致污染微生物生長繁殖［31］，探討水分、水分活度與微生物生長的關系，通過控制中藥飲片水分，解決中藥飲片在貯藏、運輸過程中微生物的過度增殖，可加強中藥飲片耐膽鹽革蘭陰性菌的控制［32］。