基于網絡藥理學探討石菖蒲有效成分治療神經退行性疾病的研究

王志芳 潘琪 張賓 徐展瓊 方永奇 王南卜

神經退行性疾病(neurodegenerative diseases,ND)是一類由于大腦和脊髓的神經元細胞變性、丟失而引起的一類不可逆轉的神經系統疾病,以發作遲緩和選擇性神經元的功能障礙為特征,主要包括阿爾茨海默癥(alzheimer disease,AD)、帕金森氏病(parkinson’s disease,PD)和肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)[1]。現在對于ND以藥物治療為主,如多奈哌齊改善AD患者的認知功能[2];左旋多巴緩解PD運動功能障礙等[3]。天南星科植物的干燥根莖石菖蒲已經被證實對ND相關疾病具有緩解作用。石菖蒲及其揮發油對AD[4-6]和PD[7-8]模型動物都具有緩解癥狀改善病理狀態的作用,通過分析石菖蒲中何種成分對ND的治療發揮主要作用有助于推動石菖蒲治療ND的機制研究。

本研究通過網絡藥理學原理篩選出石菖蒲治療ND的主要靶點,結合已發現的石菖蒲中揮發油類物質是開竅醒神作用的主要有效成分[9]。探討石菖蒲治療ND的潛在分子機制與信號通路,為今后研究石菖蒲治療ND提供更深層次的理論依據。

1 材料與方法

1.1 石菖蒲主要有效成分與靶點收集

以“Acorus tatarinowii Schott”為關鍵詞,通過中藥系統藥理學TCMSP(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)數據庫(http:// ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、Pubmed和中國知網已發表的文獻收集石菖蒲的有效成分與靶點。并篩選出符合口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,血腦屏障通透性(blood brain barrier,BBB)≥-0.3,類藥性指數篩選(drug like index,DL)≥0.10條件的成分,導入TCMSP數據庫獲取相應靶點,并用Uniprot數據(https://www.uniprot.org/)以物種名稱“Homo sapiens”為物種名稱,篩選已經驗證的靶點作為石菖蒲的有效成分或靶點。

1.2 神經退行性疾病靶點的收集

以“Alzheimer disease”“Parkinson’s disease”“amyotrophic lateral sclerosis”為關鍵詞,通過geneCards(https://www.genecards.org/),OMIM(https://www.omim.org/),TTD(https://ngdc.cncb.ac.cn/)三大數據庫收集疾病靶點,OMIM數據庫和TTD數據庫未設置篩選條件,gene Cards數據庫設定相關性評分(Relevance score)>10為篩選靶點。整合以上數據庫獲得的靶點,將得到的靶點基因名稱用Uniprot數據庫轉化成相對應的基因名稱,合并去重得到ND最終相關靶點蛋白。

1.3 蛋白互作網絡圖構建

利用R語言獲得石菖蒲活性成分靶點和ND靶點交集靶點的韋恩圖,其共有靶點作為石菖蒲治療ND的潛在作用靶點,借助String數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl),以物種為“Homo sapiens”,最小相互作用閾值為0.9作為條件,獲得蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)關系后,通過Cytoscape_v3.8.0繪制PPI網絡圖。然后將PPI網絡導入Cystoscape 3.8.0中,通過NetworkAnalyzer工具進行拓撲分析,以degree, betweenness centrality,average shortest path length和closeness centrality這四個參數為參考標準,通過degree排序,選取分值大于2倍平均分的基因作為關鍵靶點,篩選出關鍵靶點,以橫坐標為每個靶點的度值,將這些靶點使用R 4.0.3進行圖片繪制。

1.4 GO功能分析和KEGG通路富集分析

將石菖蒲和ND的交集基因列表導入String數據庫,并應用R 4.0.3進行功能富集和主要通路分析。使用Bioconductor生物信息軟件包,以P<0.05和qvalue<0.05為篩選條件,對關鍵靶點進行GO(Gene ontology)生物過程富集分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,將得到的結果用ggplot2包繪制成氣泡圖及柱狀圖。

2 結果

2.1 石菖蒲有效成分及靶點

通過TCMSP數據庫平臺檢索得到石菖蒲有效成分105個,根據OB≥30%,BBB≥-0.3,OL≥0.10的篩選條件,獲得有效成分24個。在Pubmed或中國知網檢索得到的文獻證實β-細辛醚(beta-asarone)、甲基丁香酚(Methyleugenol)、欖香素(Elemicin)是石菖蒲的重要成分[10]。因此,共獲得石菖蒲活性成分27個,具體見表1。用Uniprot數據庫將蛋白名稱轉換為基因名,得到靶基因43個。

表1 石菖蒲部分活性成分基本信息表

2.2 神經退行性疾病相關靶點

將geneCards,OMIM,TTD三大數據庫收集得到AD、PD和ALS的疾病靶點合并去重后,分別為15357、658、204個,三種疾病合并去重后共收集基因15929個。

2.3 石菖蒲—活性成分—共同靶點—神經退行性疾病網絡圖

將石菖蒲有效成分靶點和ND靶點輸入R語言的“Venn Diagram”包獲得二者相關韋恩圖(圖1),獲得交集靶點41個,獲取候選化合物中與交集靶點相關的活性成分。將篩選后的石菖蒲的主要活性成分(表1)的MOLID及對應靶點數據導入Cytoscape_v3.8.0,生成石菖蒲可視化活性成分—靶點網絡,網絡節點包括石菖蒲、石菖蒲有效成分、ND及相關靶點,連線表示節點之間的聯系。見圖2。

圖1 石菖蒲治療ND的藥物—疾病共同靶點韋恩圖

圖2 石菖蒲治療ND的“藥物—活性成分—共同靶點—疾病”

2.4 石菖蒲和神經退行性疾病靶蛋白相互作用的PPI網絡圖

將石菖蒲-ND的共有靶點借助String數據庫,獲得PPI網絡,該網絡中有41個節點,142條邊,平均度值為6.93。將PPI進行拓撲分析,選取分值大于2倍平均分的基因作為關鍵靶點,以橫坐標為每個靶點的度值,總共篩選出個18關鍵靶點,見圖3。 將度值由高到低排序,其中原癌基因蛋白(Proto-oncogene c-Fos,Fos)、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinest-erase ,ACHE)、溶質載體家族6成員4(Solute Carrier Family 6 Member 4, SLC6A4)、腎上腺素能α1B受體(Adrenergic, alpha-1B-, receptor, ADRA1B)、腎上腺素能α2A受體(Adrenergic, alpha-2A-, receptor, ADRA2A)、單胺氧化酶B(Monoamine Oxidase B, MAOB)、前列腺素內過氧化物合酶2基因(Prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、腎上腺素能α1A受體(Adrenergic, alpha-1A-, receptor, ADRA1A)等的度值排名較靠前,見表2,提示這些靶點可能是治療此類疾病的關鍵靶點。

圖3 石菖蒲治療ND的PPI網絡圖

2.5 石菖蒲與神經退行性疾病靶點的功能和通路富集分析

將石菖蒲治療ND的潛在靶點進行GO 的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細胞組分(cell component, CC)富集,引用String數據庫,將校正值P<0.05的項目進行篩選,交集靶點總共富集到364條生物過程,91項分子功能相關,43項細胞組成相關,并繪制成柱狀圖,見圖4。結果表明,主要涉及到了前的有G蛋白偶聯的胺受體活性、腎上腺素受體活性、兒茶酚胺結合、類固醇激素受體活性、神經遞質受體活性、突觸后神經遞質受體活性等。

圖4 石菖蒲治療ND的潛在作用靶點的GO分析

將石菖蒲治療ND的潛在靶點進行KEGG通路富集分析,引用String數據庫,將校正值P<0.05的項目進行篩選,總共富集到28條信號通路,繪制成柱狀圖和氣泡圖,見圖5。結果提示,神經活性配體—受體相互作用通路、鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路和唾液分泌通路富集到了較多的基因且其富集因子較高。

圖5 石菖蒲治療ND的潛在作用靶點的KEGG信號通路富集分析

3 討論

ND的致病因素非常多樣,現有藥理研究阻斷一個或兩個途徑不能明顯減少神經元全面的功能障礙和損失。且此類疾病伴隨的病理變化通常是不可逆的,在患者出現認知或運動障礙等臨床癥狀時,病程往往已到中晚期,此時介入治療不能從根本上逆轉神經元的損傷。中醫學認為ND屬于中醫“癡呆”“顫證”“偏癱”等范疇,為本虛標實之證,病因主要因為各種致病因素導致痰濁上蒙清竅,當采用化痰開竅醒神的治療方法。如ALS病因可由于外感溫濕邪毒等致臟腑虧虛、肌肉筋脈失養[11]。王永炎院士認為氣血虧虛,痰、濁和瘀是AD的病因[12]。現有研究發現,具有芳香開竅作用的中藥對AD和PD等神經退行性疾病的治療和基礎研究,可以有效的改善患者癥狀的臨床作用[13]。所以,在治療方面應以清熱化痰息風、活血化瘀息風為主。石菖蒲具有化濁祛痰、開竅寧神的作用,常用于ND的治療。

在本研究的石菖蒲主要成分靶點和ND相關靶點中,交集靶點達到41個,提示石菖蒲治療ND可能是多成分、多靶點共同作用的結果,如別香樹烯、白菖油萜 、異紫花前胡內酯、佛手苷內酯、β-細辛醚、甲基丁香酚、欖香素等成分都具有開發成治療ND藥物的潛在市場。前期研究發現,從石菖蒲中提取的β-細辛醚可激活PINK1-Parkin介導的線粒體自噬而影響AD的病理,改善APP/PS1小鼠的學習和認知障礙[14],發揮快速抗AD的作用[15]。 在β-細辛醚對PD模型大鼠作用效果的研究中發現,當β-細辛醚聯合左旋多巴可增PD大鼠的強紋狀體中多巴脫羧酶表達及兒茶酚-O-甲基轉移酶、酪氨酸羥化酶水平,提高紋狀體中多巴胺水平,具有一定的神經保護作用[16]。

根據石菖蒲和ND的共有靶點預測主要涉及的基因蛋白有FOS、ACHE、SLC6A4、ADRA1B、ADRA2A、MAOB、PTGS2、ADRA1A等靶點可能是治療此類疾病的關鍵靶點。現有研究發現,石菖蒲揮發油可抑制炎性痛大鼠L4～6段脊髓中細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)、環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和Fos表達[17],且海馬、下丘腦FOS的表達可影響幼齡仔鼠空間學習記憶能力[18]。AChE和Aβ聚集抑制劑具有神經保護作用,可被作為治療阿爾茨海默病的先導化合物[17]。SLC6A4的表達跟神經的生理功能關系密切[19],其表達異常會導致小鼠腦內5 -羥色胺的表達水平,從而影響小鼠的學習和記憶能力[20]。ADRA2B的一種常見遺傳多態性導致位于該蛋白第三個細胞內環上的三種谷氨酸缺失,與情緒事件增強的記憶形成有關[21]。在交集靶點涉及的通路中神經活性配體—受體相互作用通路、鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路等信號通路中,主要涉及神經的傳遞和突觸的結構和功能有關,影響記憶能力和運動能力[22]。

綜上所述,本研究系統闡述了石菖蒲治療ND的潛在物質基礎和作用機制,為深入研究提供了相應的理論基礎。我們后續會進一步對石菖蒲治療ND相關疾病的成分篩查和靶點或通路的驗證提供更多依據。