不同頻率摩腹對脾虛型功能性消化不良家兔胃腸動力的調控規律及其與CaM-MLCK信號通路相關性研究

張強 王繼紅 黃志凱 蔡偉藍 任雪晗 許嘉英

功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是臨床上常見的功能性胃腸疾病之一,全球發病率約為8%～30%[1],迄今為止尚無特異性治療方法[2]。近年來的研究表明FD的發病與胃腸動力障礙密切相關。摩腹可改善胃腸動力,治療FD療效確切[3-5]。前期研究表明,摩腹的頻率不同,其治療效應亦會隨之改變,但其對胃腸動力的作用規律和機制尚未明確[6-8]。因此,本研究嘗試從調控胃腸道平滑肌收縮的經典通路——鈣調蛋白—肌球蛋白輕鏈激酶(caImodulin-myosin light chain kinase,CaM-MLCK)信號通路著手,觀察不同頻率摩腹對脾虛型FD家兔胃腸動力的調控規律,分析其調控作用與CaM-MLCK信號通路的相關性,探討摩腹的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年新西蘭家兔60只,由山東康大生物科技有限公司提供[動物合格證號:SCXK(魯)20160002],雌雄各半,體質量(2.0±0.5)kg。所有家兔在廣州中醫藥大學科技產業園動物房飼養,室溫條件(21±3)℃ ,相對濕度保持在(35±2)%,保持晝夜光照正常及飼養環境安靜。

1.2 儀器與試劑

實驗采用疆越科技研制730C型人工智能機械臂(DOBOT 魔術師/型號:DT-MG-4R005-02E)、TEKSCAN壓力測試調制器(上海邑成測試設備有限公司生產)、MFF多點薄膜壓力傳感器、校對器、動態數據采集器、家兔固定器(上海化科實驗器材,PVC-01)、兔解剖臺、解剖器械。試劑包括環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cMAP)酶聯免疫吸附試劑盒(品牌:Elabscience;貨號:E-EL-0056c)、三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)酶聯免疫吸附試劑盒(品牌:FineTest;貨號:EU3119)、P物質(Substance P,SP)定量檢測試劑盒(ELISA)(品牌:茁彩生物;貨號:ZC-52333-J)、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)含量檢測試劑盒(品牌:索萊寶;貨號:BC0305;規格:100t/96s)及總一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測試劑盒(品牌:碧云天;貨號:S0023)。

1.3 實驗分組

適應性喂養7天后,將60只家兔隨機分為空白組、模型組、低頻摩腹治療組、高頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組,每組10只。其中空白組正常喂養,不予造模,不施加手法干預,其余5組全部造脾虛FD模型。其中模型組不施加手法干預;低頻摩腹治療組的摩腹頻率為101～150次/分鐘;高頻摩腹治療組的頻率為201～250次/分鐘;低頻摩腹+抑制劑組在低頻摩腹治療的基礎上加予腹腔注射肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑(ML 9 hydrochloride,ML-9);高頻摩腹+抑制劑組在高頻摩腹治療的基礎上加予腹腔注射ML-9。實驗過程中存在部分家兔死亡導致數據脫落的情況,最終采集到的數據分布為:空白組、高頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組家兔,各8只,模型組及低頻摩腹治療組家兔各7只,高頻摩腹+抑制劑組家兔9只;納入統計的家兔樣本總量為47只。

1.4 動物造模

本實驗采用苦寒瀉下法及饑飽失常法造脾虛FD家兔模型[9]。第1～9天:將大黃35 g、厚樸27 g、枳實18 g置于裝有650 mL蒸餾水的藥鍋中浸泡30分鐘,煮沸45分鐘,用紗布及濾紙過濾藥渣,用燒瓶盛裝過濾好的藥液,用70℃的恒溫旋轉蒸發儀將燒瓶中的藥液濃縮至1 g/mL,共80 mL,根據家兔體重用注射器按6 mL/kg灌胃給藥,隔日一次;第10～12天:灌飼大黃番瀉葉芒硝合劑(每12 mL藥液含大黃6 g、番瀉葉3 g、芒硝1 g),根據家兔體重,按12 mL/kg給藥,灌胃頻率每日一次;第13～18天:灌飼大黃番瀉葉芒硝合劑(每18 mL藥液含大黃6 g、番瀉葉3 g、芒硝1.2 g),根據家兔體重,按18 mL/kg給藥,灌胃頻率每日一次。灌胃期間喂食飼料量減半。造模期間觀察記錄家兔精神、體重、進食量及大便的變化和行為學改變,經家兔行為學量表評估所示各組樣本均符合脾虛模型標準,造模成功。

1.5 干預方法

人工智能機械臂端安裝擬人硅膠手指并連接控溫器,使硅膠手指保持在人體正常體溫范圍(36～37℃),兩名助手分別握持家兔前后肢,將其仰臥位束縛于操作臺上,充分暴露腹部,使機械臂指端輕落于施術穴位,在MFF多點薄膜壓力測試系統下使指端與穴位皮膚間壓力固定為100 mN,摩腹方向保持一致,設置低頻摩腹治療組及低頻摩腹+抑制劑組摩腹頻率為101～150次/分鐘,高頻摩腹治療組及高頻摩腹+抑制劑組頻率為201～250次/分鐘,每只家兔每穴推5分鐘,共計15分鐘,每日1次。低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組每日手法治療后均進行腹腔注射ML-9(2 mg/kg),連續干預10天。(家兔穴位定位參照《實驗針灸學》對家兔取穴方法[10],中脘穴:前腹部正中線上,劍狀軟骨與臍連線中點處;天樞穴:臍旁開三厘米處。手法干預前各組家兔均已備皮并標記穴位。)

1.6 樣本處理及指標檢測

所有家兔于干預結束次日禁食24小時(不禁水),第三日早上用2.5 mL含有5%炭末和2%羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na)的混懸液對所有家兔進行灌胃,于灌胃結束半小時后采用空氣栓塞法處死家兔,剖開腹腔,將家兔小腸腸管(幽門至回盲部)完整取出并測量長度,此即小腸總長度,測量炭末前沿距離幽門部的長度,得炭末推進長度,根據小腸推進率(%)=(炭末推進長度/小腸總長度)×100%計算各組家兔的小腸推進率。測量完小腸總長度及炭末推進率后取下家兔小腸組織及胃組織各一塊,每只家兔小腸組織取樣部位為空腸,胃組織取樣部位為胃竇。將樣本剪碎置于空白管中,按重量制成組織勻漿,取上清液保存于冰箱,用相應試劑盒分別檢測胃組織中NO、SP、IP3、ATP、cAMP的含量和腸組織中IP3、ATP、cAMP的含量。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組家兔小腸推進率的比較

與空白組相比,模型組小腸推進率顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,低頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組小腸推進率顯著升高(P<0.01),高頻摩腹治療組與模型組相比無統計學差異(P>0.05)。低頻摩腹+抑制劑組與低頻摩腹治療組、高頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹治療組相比,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組家兔小腸推進率

2.2 各組家兔胃組織NO、SP含量的比較

胃組織NO含量的比較:與空白組相比,模型組含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比,低頻摩腹治療組含量下降(P<0.05),其余手法干預組均無統計學差異(P>0.05);低頻摩腹+抑制劑組與低頻摩腹治療組相比、高頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹治療組相比,胃NO均升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組家兔胃組織NO、SP、IP3、ATP、cAMP含量比較

胃組織SP含量的比較:與空白組相比,模型組含量顯著下降(P<0.01);與模型組相比,高頻摩腹治療組與高頻摩腹+抑制劑組含量均升高(P<0.05),低頻摩腹治療組及低頻摩腹+抑制劑組含量顯著升高(P<0.01);低頻摩腹+抑制劑組與低頻摩腹治療組、高頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹治療組相比無統計學差異(P>0.05)。見表2。

2.3 各組家兔胃腸組織IP3、ATP、cAMP含量的比較

胃腸組織IP3含量的比較:模型組與空白組相比差異無統計學意義(P>0.05);與模型組相比,摩腹干預后的四組小腸組織IP3含量均顯著下降(P<0.01);低頻摩腹+抑制劑組與高頻摩腹+抑制劑組胃、腸組織IP3含量均顯著下降(P<0.01)。見表2、表3。

表3 各組家兔小腸組織IP3、ATP、cAMP含量比較

胃腸組織ATP含量的比較:與空白組相比,模型組腸ATP含量下降(P<0.05),模型組胃ATP含量顯著下降(P<0.01);與模型組比,高頻摩腹治療組腸ATP含量升高(P<0.05)、胃ATP含量無統計學差異(P>0.05),低頻摩腹治療組胃、腸ATP含量均顯著升高(P<0.01);與低頻摩腹治療組相比,低頻摩腹+抑制劑組胃、腸ATP含量均顯著下降(P<0.01);與高頻摩腹治療組相比,高頻摩腹+抑制劑組胃ATP含量下降(P<0.05)、腸ATP含量顯著下降(P<0.01)。見表2、表3。

胃腸組織cAMP含量的比較:與空白組相比,模型組腸cAMP含量升高(P<0.05),胃cAMP含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比,低頻摩腹治療組胃、腸cAMP含量均顯著下降(P<0.01),高頻摩腹治療組胃、腸cAMP含量均無統計學差異(P>0.05),低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組含量胃、腸cAMP均顯著升高(P<0.01)。見表2、表3。

3 討論

當胞內Ca2+水平受信號刺激升高到一水平時,鈣調蛋白(caImodulin,CaM)與Ca2+的結合體(Ca2+-CaM)將與肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)結合,激活CaM-MLCK信號通路(見圖1),使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)磷酸化,活化肌球蛋白ATP酶,觸發纖絲滑動,并使ATP水解供能,引起平滑肌收縮[11]。當胞內Ca2+濃度下降,Ca2+-CaM復合物減少或解離,引起MLC去磷酸化,則平滑肌松弛;與此同時,cAMP可活化cAMP依賴性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA),通過cAMP/PKA途徑引起平滑肌松弛[12]。IP3通過與IP3受體結合促使鈣池操縱性鈣內流(store-operated Ca entry,SOCE)的發生,鈣池耗竭并觸發胞外Ca2+的內流,促進激活CaM-MLCK信號通路。NO是消化系統中的抑制性神經遞質,可通過環磷酸鳥苷/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G,cGMP/PKG)途徑或抑制胞內Ca2+濃度升高而使平滑肌松弛。SP屬于興奮性神經肽, 可直接或通過激活磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)促進IP3的產生而間接使消化道平滑肌收縮;ML-9可直接抑制MLCK活性,也可通過抑制SOCE降低胞內Ca2+濃度從而阻斷CaM-MLCK信號通路。

注: 本圖為筆者據相關研究資料繪制。

既往研究提示,部分健脾中藥方可通過影響CaM-MLCK信號通路從而影響平滑肌收縮,促進胃腸動力[13-15]。在推拿干預消化疾病研究方面,張瑋等[16]和石玉生等[17]通過一項腹部推拿干預非酒精性脂肪肝病大鼠的隨機對照試驗證實腹部推拿可以影響MLCK的表達,調控MLCK信號通路,從而改變腸道黏膜功能。前期研究曾嘗試探索腹部一指禪推法對脾虛家兔的作用及其與MLCK信號通路的關系,但尚未發現確切聯系,指出一指禪推法可能通過多通路多途徑影響胃腸道功能[18-19]。

本研究在前期研究的基礎上進一步增加樣本量與檢測指標。研究結果顯示,家兔經造模后,除胃腸組織IP3外,其余檢測指標均發生明顯變化。摩腹干預結果提示,低頻摩腹治療組、低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組小腸推進率均顯著提高。低頻摩腹治療組逆轉造模所致各項指標水平變化的效果顯著,其中降低胃腸cAMP含量、升高胃SP含量的效果尤佳;高頻摩腹治療組也可升高胃SP含量,但對造模后其余指標的變化幾乎無改善作用甚至部分變化有加重趨勢。在CaM-MLCK信號通路被抑制的情況下,低頻摩腹+抑制劑組胃NO含量與胃腸cAMP含量的變化與模型組相似;低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組胃SP含量升高效果均與相應單純摩腹治療組無差異。值得一提的是,在造模并未影響胃腸IP3含量的基礎上,低頻摩腹治療組與高頻摩腹治療組腸IP3含量下降,低頻摩腹+抑制劑組及高頻摩腹+抑制劑組的胃腸組織IP3含量呈顯著下降趨勢。

綜上所述,摩腹對胃腸動力的影響存在頻率—效應規律,摩腹在101～150次/分鐘頻率段時可顯著促進胃腸動力,當頻率超過200次/分時,摩腹對胃腸動力無改善作用,甚至有損害趨勢。通過比較,摩腹調控胃腸動力的機制可能如下:(1)摩腹通過降低胃腸組織中NO及cAMP的含量,抑制cAMP/PKA途徑及cGMP/PKG途徑,減少對Ca2+-CaM的競爭性消耗,從而促進上游CaM-MLCK信號通路中Ca2+、Ca2+-CaM與MLCK的結合。(2)當CaM-MLCK信號通路被阻斷后,一方面,摩腹可通過提高家兔胃SP含量,發揮其促進胃腸動力的直接效應;另一方面,IP3的顯著下降提示,阻斷CaM-MLCK信號通路,可能增加IP3的消耗促使SOCE發生,從而改變胞內Ca2+水平,激發Ca2+介導的其它信號通路,使胃腸動力受到影響。其具體機制仍需進一步深入研究。本研究主要從側面探討了摩腹對胃腸動力的調控機制及與CaM-MLCK信號通路的關系,涉及指標及相關通路范圍較大,今后的研究尚需縮窄定位,對摩腹干預下CaM-MLCK信號通路上CaM、MLCK、MLC各物質的具體變化以及胃腸道平滑肌運動學改變等進行檢驗,以期進一步明確摩腹調控胃腸動力的具體機制。