大蒜體細胞胚發生及不同發育階段的形態解剖學特征

李 萍,劉 敏,邢曉東,李夢倩,張 蒙,周 蓉,蔣芳玲,吳 震

(南京農業大學 園藝學院/農業農村部華東地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,南京 210095)

大蒜(AlliumsativumL.)為1a或2a生草本植物,其鱗莖、花薹和嫩葉不僅可作蔬菜食用,還可入藥,是世界范圍內重要的食藥兼用作物。大蒜通常不育,因其不能形成種子而通過鱗莖或者氣生鱗莖進行無性繁殖,長期無性繁殖易造成病毒積累,導致產量和品質下降,給大蒜生產帶來不利影響[1]。由于植物組織培養具有顯著的脫除病毒效果,因而有希望成為大蒜脫除病毒、恢復種性的有效手段[2]。

相較于其他組織培養途徑,體細胞胚發生途徑具有再生植株結構完整、繁殖系數高和遺傳穩定性強等諸多優點。已有研究表明,可可[3]、木薯[4]、甘蔗[5]和大蒜[1]等植物可通過體細胞胚發生途徑有效脫除病毒。在藍桉[6]、香菜[7]、唐菖蒲[8]、大蒜[9]等植物中,已證實通過體細胞胚發生途徑形成的植株遺傳穩定。因此,建立高效穩定的大蒜體細胞胚發生體系,對于高效脫除病毒,乃至進行大蒜種質資源創新,均具有重要意義。同時,通過對體細胞胚發生過程中的形態解剖學特征進行觀察,明確其發生階段和典型特征,有助于更全面了解體細胞胚發生過程,從而提高體細胞胚發生及植株再生效率[10]。目前,雖然國內外學者已初步誘導獲得大蒜體細胞胚和再生植株,但總的來說,大蒜通過體細胞胚發生和成苗體系還不夠成熟,關于大蒜體細胞胚發生過程中的細胞超微結構特征還未見報道,需要做進一步研究。

本試驗在課題組前期工作基礎上,以大蒜品種 ‘二水早’ 為試材,研究不同外植體、不同植物生長調節劑及其組合對大蒜體細胞胚發生過程的影響,同時進行形態、組織和超微結構特征觀察,旨在確立大蒜體細胞胚發生的最佳誘導和培養條件,明確大蒜體細胞胚發生的不同階段及其形態解剖學特征,為建立基于體細胞胚發生途徑的大蒜試管苗高效培養體系提供理論依據和技術 支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養

以大蒜品種 ‘二水早’ 為材料,分別以大蒜花序軸、鱗莖盤、發芽葉基及氣生鱗莖和蒜瓣的無菌試管苗根尖、根段、嫩葉為外植體。供試大蒜 ‘二水早’ 在南京農業大學園藝學院保存,種植于南京農業大學牌樓教學科研基地。10月上旬進行大蒜播種,從第2年3月下旬開始,在蒜薹的花莖發育相對高度(花莖高度/假莖高度)為1,花序軸上表面直徑為0.3～0.5 cm時,陸續采收蒜薹,備用。第2年6月上旬收獲大蒜鱗莖和氣生鱗莖。挑選健康、大小一致的蒜薹、蒜瓣和氣生鱗莖作為外植體材料進行試驗。

接種前對外植體進行消毒處理,方法如下:剪下帶2 cm左右花莖的蒜薹總苞(以花序軸為外植體),剝去蒜瓣或氣生鱗莖外層的表皮,先置于飽和洗衣粉溶液中浸泡30 min,流水沖洗15～30 min,然后在超凈工作臺用75%酒精消毒90 s,無菌水清洗1次。再用2%次氯酸鈉溶液消毒,其中,氣生鱗莖消毒4～6 min,蒜薹和蒜瓣消毒8～12 min。再用無菌水清洗5次,最后置于無菌濾紙上吸干表面水分,待用。

蒜瓣和氣生鱗莖無菌試管苗培養:(1)蒜瓣無菌苗:將消毒蒜瓣去除貯藏葉和營養葉,切去蒜瓣底部約1 mm的木栓化組織,留下3～5 mm的帶莖尖的鱗莖盤,按十字型切成大小均勻的4份,接種到B5+ 2.0 mg/L6-BA + 0.1 mg/L NAA + 0.65%瓊脂 + 3%蔗糖(pH為5.8)的培養基中培養無菌試管苗;(2)氣生鱗莖無菌苗:將消毒的氣生鱗莖接種到MS + 0.65%瓊脂 + 3%蔗糖(pH為5.8)的培養基中培養無菌試管苗。培養條件均為:溫度(25±1)℃,光周期12 h/12 h,光照強度40～50 μmol/(m2·s)。

1.2 植物生長調節劑和外植體對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響

1.2.1 2,4-D 以大蒜花序軸、鱗莖盤和發芽葉基為外植體,誘導胚性愈傷組織,設置0、1.0、 2.0、3.0和4.0 mg/L 5個2,4-D質量濃度,共15種處理組合。以B5培養基為基本培養基,除不同質量濃度2,4-D外,均加入質量濃度為0.5 mg/L的KT,0.7%瓊脂和3%蔗糖,pH調為5.8,接種后在(25±1)℃下黑暗培養。

以花序軸為外植體:取大蒜消毒總苞,剝去外層總苞片,去除退化的花原基殘留物,切取帶2～3 mm花莖的花序軸,縱切分成均勻2份接種于培養基;以鱗莖盤為外植體:取消毒蒜瓣,去除貯藏葉和營養葉,切去蒜瓣底部約1 mm的木栓化組織,保留3～5 mm帶莖尖的鱗莖盤,按十字型切成大小均勻的4份接種于培養基;以蒜瓣發芽葉基為外植體:取消毒蒜瓣,去除貯藏葉及莖盤部分,留下發芽葉基部約5 mm,縱切均勻分成2份接種于培養基。每個培養皿接種4份外植體,每個處理接種15個培養皿,3次重復。培養過程中觀察和記錄胚性愈傷組織誘導和生長狀態,60 d后統計胚性愈傷組織誘導率。

1.2.2 毒莠定(Picloram,PIC) 以鱗莖盤為外植體,探究不同質量濃度PIC對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響。設置0、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L 5個PIC質量濃度,共5種處理。以B5培養基為基本培養基,除不同質量濃度PIC外,均加入質量濃度為0.1 mg/L的NAA,0.7%瓊脂和3%蔗糖,pH調為5.8。外植體接種前的處理同 “1.2.1”。每個培養皿接種4份外植體,每個處理接種10個培養皿,3次重復。接種后在 (25±1) ℃下進行黑暗培養。培養過程中觀察和記錄胚性愈傷組織誘導和生長狀態,60 d后統計胚性愈傷組織誘導率。

1.2.3 外植體 以蒜瓣和氣生鱗莖誘導的無菌試管苗的根尖、根段和嫩葉為外植體,分別接種在B5 + 3.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L KT+0.7%瓊脂 + 3%蔗糖(pH為 5.8)的培養基中,進行胚性愈傷組織誘導。無菌試管苗的根尖、根段和嫩葉均切割為長5 mm的小段。每個培養皿接種 4～6份外植體,每個處理接種10個培養皿,3次重復。接種后在(25±1)℃進行黑暗培養。培養過程中觀察和記錄胚性愈傷組織誘導和生長狀態,60 d后統計胚性愈傷組織誘導率。

1.3 不同質量濃度組合2,4-D和6-BA對大蒜體細胞胚萌發的影響

胚性愈傷組織在原培養基上繼續培養,經 1～2月至大量球形胚形成。以發育狀態良好的球形胚為材料,以MS培養基為基本培養基,添加不同質量濃度2,4-D和6-BA,其中2,4-D質量濃度設置 0.25、1.0和3.0 mg/L,6-BA質量濃度設置 0.5、2.0和4.0 mg/L,共9種處理組合。培養基中均加入0.7%瓊脂和3%蔗糖,pH調為5.8。每個培養皿接種0.3 g球形胚,3次重復,接種后在(25±1)℃下黑暗培養。待觀察到體細胞胚發育成熟,開始萌發時,將體細胞胚轉移至無植物生長調節劑的MS培養基中,采用光照培養,光周期為12 h/12 h,光照強度為40～50 μmol/(m2·s)。培養過程中觀察體細胞胚發育狀況并拍照,30 d后統計體細胞胚的萌發數,并計算萌發系數。

1.4 大蒜體細胞胚發生不同階段的形態解剖學特征

將大蒜花序軸接種在B5+ 3.0 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L KT + 0.7% 瓊脂 + 3% 蔗糖(pH為 5.8)的培養基上,在(25±1)℃下黑暗培養。培養過程中分別利用體視顯微鏡、正置熒光顯微鏡和透射電鏡觀察體細胞胚發生過程,明確大蒜體細胞胚發生不同階段的變化特點,并確定其形態、組織和超微結構特征。

1.4.1 形態學特征觀察 取大蒜體細胞胚發生過程不同時期的培養物,置于Leica DFC7000T體式顯微鏡下進行形態觀察并拍照,確定體細胞胚發生不同階段的形態特征。

1.4.2 組織學觀察 采用常規石蠟切片法制備大蒜體細胞胚發生不同時期培養物的組織切片。培養材料先固定在FAA(V甲醛∶V冰醋酸∶V70%乙醇=1∶1∶18)溶液中,立即抽真空使其沉入試管底部,固定24 h后,進行系列乙醇逐級脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片(厚度為8 μm),甲苯胺藍染色和中性樹膠封片等操作,最后將切片置于Leica DFC450C正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 超微結構觀察 根據形態組織學特征,取外植體、愈傷組織、初期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚五個階段的培養物,迅速投入電鏡固定液(2.5%戊二醛溶液)中固定,立即抽真空使其沉入試管底部,室溫放置2 h,然后轉入 4 ℃冰箱。固定好后送由武漢賽維爾生物科技有限公司制片,制片過程包括脫水,滲透,包埋,利用Leica UC7超薄切片機60～80 nm超薄切片,鈾鉛雙染色等一系列步驟,最后將切片置于Hitachi H-7650透射電鏡下觀察并拍照。

1.5 試管鱗莖的形成和植株生長狀態觀察

體細胞胚萌發形成的試管植株,經90 d培養后可形成試管鱗莖。將試管鱗莖在4 ℃冰箱冷藏1個月打破休眠,然后播種到經過高壓滅菌后的復合基質中,復合基質由草炭、珍珠巖、蛭石按體積比2∶1∶1配制。植株生長過程中定期澆水和營養液。播種15 d后統計試管鱗莖的萌發率, 45 d后統計試管鱗莖苗的成活率。

1.6 調查項目與方法

胚性愈傷組織誘導率=產生胚性愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100%

體細胞胚萌發系數=萌發苗數/接種的球形胚鮮質量

試管鱗莖萌發率=萌芽的試管鱗莖數/播種的試管鱗莖總數×100%

試管鱗莖苗成活率=存活的試管鱗莖苗數/萌芽的試管鱗莖總數×100%

2 結果與分析

2.1 植物生長調節劑和外植體對大蒜胚性愈傷組織誘導的影響

2.1.1 2,4-D的影響 2,4-D質量濃度不同,大蒜花序軸、鱗莖盤和發芽葉基的胚性愈傷組織誘導率和形成狀態存在差異(表1)。以花序軸為外植體,2,4-D質量濃度從1.0升高到3.0 mg/L,胚性愈傷組織誘導率由37.22%提高至82.22%,當2,4-D質量濃度為4.0 mg/L時,胚性愈傷組織誘導率為81.11%,與3.0 mg/L差異不顯著,但其誘導形成的胚性愈傷組織的量較少。以鱗莖盤為外植體,在2,4-D質量濃度為2.0和3.0 mg/L時,胚性愈傷組織誘導率較高,分別為 89.21%和89.50%,但2,4-D質量濃度為3.0 mg/L時,形成胚性愈傷組織的量較少。對于發芽葉基,在2,4-D質量濃度為 2.0和3.0 mg/L時,胚性愈傷組織誘導率較高,分別為82.52%和 83.40%,且形成的胚性愈傷組織的量較多。在不添加2,4-D的培養基中,3種外植體均未能誘導形成胚性愈傷組織。

表1 大蒜不同外植體在不同質量濃度2,4-D處理下的胚性愈傷組織誘導Table 1 Embryogenic callus induction of different garlic explants under different mass concentrations of 2,4-D

2.1.2 PIC的影響 不同質量濃度PIC誘導大蒜鱗莖盤形成胚性愈傷組織的情況見表2。隨著PIC質量濃度的升高,胚性愈傷組織誘導率先升后降。當PIC質量濃度為4.0 mg/L時,胚性愈傷組織誘導率最高,為67.5%。培養基中未添加PIC,不能誘導外植體形成胚性愈傷組織。PIC質量濃度為2.0和4.0 mg/L,誘導形成胚性愈傷組織的量多,表面較光滑,呈顆粒狀。PIC質量濃度為1.0和8.0 mg/L,誘導形成的胚性愈傷組織的量少,呈顆粒狀,表面較粘稠。

表2 大蒜鱗莖盤在不同質量濃度PIC處理下的胚性愈傷組織誘導Table 2 Embryogenic callus induction of garlic bulb disc under different mass concentrations of PIC

2.1.3 外植體的影響 由表3可知,氣生鱗莖和蒜瓣無菌試管苗不同部位誘導形成胚性愈傷組織的效果存在差異。以氣生鱗莖和蒜瓣無菌試管苗根尖為外植體,其胚性愈傷組織誘導率均顯著高于根段和嫩葉。其中,以氣生鱗莖無菌試管苗根尖為外植體,胚性愈傷組織誘導率最高,達 96.00%,蒜瓣無菌試管苗根尖次之,為80.00%。無菌試管苗不同部位誘導形成的胚性愈傷組織,外觀形態上均表現為表面光滑、呈顆粒狀,氣生鱗莖無菌試管苗根尖和根段誘導形成的胚性愈傷組織的量 較少。

2.2 不同質量濃度的2,4-D和6-BA組合對大蒜體細胞胚萌發的影響

不同質量濃度2,4-D和6-BA組合對大蒜體細胞胚發育和成熟萌發有顯著影響(表4)。2,4-D 0.25 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L的組合,體細胞胚萌發系數最高,達35.56個/g。隨著2,4-D和6-BA質量濃度的升高,體細胞胚萌發系數降低。當2,4-D質量濃度升至3.0 mg/L時,不能誘導體細胞胚萌發成苗。以上結果說明,高質量濃度的2,4-D和6-BA不利于大蒜體細胞胚的發育,促進大蒜體細胞胚成熟萌發的適宜植物生長調節劑組合為:2,4-D 0.25 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L。

表4 大蒜體細胞胚在不同質量濃度2,4-D和6-BA組合處理下的萌發系數Table 4 Germination coefficient of garlic somatic embryos under different mass concentration combinations of 2,4-D and 6-BA

2.3 大蒜體細胞胚發生過程中的形態解剖學特征觀察

2.3.1 形態學特征 以花序軸(圖1-A)為外植體,在胚性愈傷組織誘導培養基上培養7 d后,其頂端出現密集的點狀突起。培養至第13天,花序軸頂端形成一層半透明的物質,表面不光滑,為愈傷組織(圖1-B)。至第20天,愈傷組織的局部開始出現表面光滑、半透明的顆粒狀突起,表明胚性愈傷組織開始形成。培養至第27天,在愈傷組織的局部形成明顯的顆粒狀突起,為初期胚性愈傷組織(圖1-C)。隨著培養時間繼續延長,形成的顆粒狀突起不斷增多,體積不斷變大。至第60天,顆粒狀突起幾乎完全覆蓋外植體,形成了大量胚性愈傷組織,為后期胚性愈傷組織(圖1-D)。培養至第90天,胚性愈傷組織進一步發育,形成半透明、表面光滑的球狀體,即為球形胚。培養至第120天,可觀察到大量球形胚的形成(圖1-E)。球形胚逐漸與母體產生生理隔離,最后可以從母體剝落分離(圖1-F)。此后,球形胚進一步發育,形成梨形胚(圖1-G)、子葉形胚(圖1-H),最后可觀察到子葉形胚萌發成苗,形成具有芽和根的完整植株(圖1-I)。

A.外植體; B.愈傷組織; C.初期胚性愈傷組織; D. 后期胚性愈傷組織; E、F. 球形胚; G.梨形胚; H.子葉形胚; I.體細胞胚萌發形成的小植株。白色箭頭所指處,CA為愈傷組織,EC為胚性愈傷組織,GE為球形胚

2.3.2 組織學特征 以花序軸為外植體,觀察大蒜體細胞胚發生不同階段的組織學特征,結果見圖2。在愈傷組織形成階段,外植體表層組織(圖2-A)經脫分化后,形成體積較大、形狀不規則的薄壁細胞(圖2-B),它們排列疏松,高度液泡化,細胞核很小或觀察不到細胞核。在初期胚性愈傷組織階段,薄壁細胞進一步形成胚性細胞團,這些細胞比薄壁細胞小,排列緊密,細胞核大而明顯(圖2-C),具有較強的分裂能力,可以不斷進行細胞分裂(圖2-D)。后期胚性愈傷組織,隨著薄壁細胞不斷轉化為胚性細胞及胚性細胞的分裂,形成多個由大量胚性細胞構成的原胚,原胚呈顆粒狀(圖2-E),其組織學觀察的發育階段與形態學觀察結果一致。在球形胚階段,組成球形胚的細胞體積比較小,呈近圓形,細胞排列規則,細胞核大而明顯。球形胚尚未觀察到維管束的形成(圖2-F)。

A.外植體(×20); B. 愈傷組織(×20); C. 初期胚性愈傷組織(×20); D. 初期胚性愈傷組織(×63); E. 后期胚性愈傷組織 (×10); F. 球形胚(×10)。圖中黑色箭頭所示為正在分裂的細胞。圖A～C、F標尺為100 μm;圖D標尺為50 μm;圖E標尺為200 μm

2.3.3 超微結構特征 依據通過形態組織學特征劃分的體細胞胚發生不同階段,觀察大蒜體細胞胚發育不同階段在細胞超微結構水平上的特征,結果見圖3。在愈傷組織形成階段,細胞高度液泡化,細胞核小且被擠到了一側,細胞器種類少,細胞質稀薄,局部有線粒體分布,細胞排列疏松,存在細胞間隙,為典型的薄壁細胞(圖3-A、3-B)。在初期胚性愈傷組織階段,細胞核大,細胞質濃稠,細胞器比較豐富,原來的中央大液泡消失,出現較多的小液泡,存在大量線粒體,還觀察到內質網和高爾基體等細胞器,細胞之間有胞間連絲分布(圖3-C、3-D);在后期胚性愈傷組織階段,出現細胞核向細胞一端偏移的現象,另一端有大液泡的形成,細胞質少且貼壁分布,細胞質中有線粒體和前質體存在(圖3-E、3-F)。在球形胚階段,細胞核大而明顯,有較多小液泡,細胞質濃稠且有前質體和較多線粒體的分布(圖3-G、3-H)。

A.愈傷組織(×700); B. 愈傷組織(×2 500); C. 初期胚性愈傷組織(×2 000); D. 初期胚性愈傷組織(×6 000); E. 后期胚性愈傷組織(×1 200); F. 后期胚性愈傷組織(×3 000); G. 球形胚(×500); H. 球形胚(×5 000);v. 液泡; n. 細胞核; m. 線粒體; g. 高爾基體; e. 內質網; p. 前質體; pd. 胞間連絲

2.4 經大蒜體細胞胚發生途徑的試管鱗莖形成與植株生長狀態

通過體細胞胚發生途徑獲得的再生植株(圖4-A),繼續培養90 d后,可形成試管鱗莖(圖4-B、4-C)。將試管鱗莖置于4 ℃冰箱冷藏30 d打破休眠,播種在經過高壓滅菌的由草炭、珍珠巖、蛭石按2∶1∶1比例配制的復合基質中。播種并澆足水,之后在基質表面干燥時澆水,每隔7 d澆施1次營養液。播種15 d后進行統計,試管鱗莖的出芽率為70.73%;45 d后統計,試管鱗莖苗(圖4-E)成活率為96.55%(表5)。

A.體細胞胚發生途徑形成的試管苗; B.試管鱗莖的形成; C.試管鱗莖; D.試管鱗莖萌發; E.試管鱗莖苗的生長

表5 大蒜體細胞胚發生途徑獲得的試管鱗莖萌發成苗情況Table 5 Statistics on germination of garlic bulblets obtained by somatic embryogenesis

3 討 論

體細胞胚發生是大多數植物生命周期中的獨特過程,已成為植物生物技術的重要工具,主要應用于商業化的大規模繁殖和作物改良[11]。植物體細胞胚發生可分為間接發生和直接發生兩種:前者是由外植體先形成胚性愈傷組織,再由胚性愈傷組織發育形成體細胞胚,是最常見的體細胞胚發生方式;后者是外植體不經過愈傷組織階段而直接形成體細胞胚[12]。據報道,Sata等[13]通過直接發生途徑獲得了大蒜體細胞胚,而其他有關大蒜體細胞胚發生的研究幾乎都是通過間接發生途徑。

生長素被認為是影響植物體細胞胚發生最關鍵的因素之一,許多植物體細胞胚發生的啟動都需要外源添加生長素類物質。2,4-D是一種合成的生長素,可強烈誘導細胞去分化,用于誘導胚性愈傷組織的2,4-D可以單獨使用或組合使用,這取決于植物的種類。在擬南芥中,單獨添加2,4-D可誘導形成胚性愈傷組織[14],大蒜胚性愈傷組織的誘導通常是2,4-D與KT或2,4-D與6-BA組合[15-17],施加2,4-D質量濃度通常在1.0～4.0 mg/L。本研究利用2,4-D和KT組合誘導大蒜胚性愈傷組織,2,4-D質量濃度在2.0和3.0 mg/L時,大蒜胚性愈傷組織誘導效果較好,不同外植體之間略有差異。胚性愈傷組織誘導培養基中施加2,4-D會增加培養物的內源激素水平并使細胞產生氧化脅迫,從而誘導體細胞獲得胚胎發生能力[18]。另外,在香蕉[19]和郁金香[20]等植物中,PIC在其胚性愈傷組織的誘導中發揮著重要作用,而2,4-D、PIC和NAA都被認為影響百合胚性愈傷組織誘導的關鍵因素[21-22],本試驗發現PIC誘導大蒜胚性愈傷組織的效果不如2,4-D。

外植體是影響植物體細胞胚發生的又一個關鍵因素。本研究比較了多種大蒜外植體胚性愈傷組織誘導的差異,結果表明,大蒜 ‘二水早’ 的花序軸、鱗莖盤和發芽葉基均為較好的胚性愈傷組織誘導外植體,蒜瓣和氣生鱗莖無菌試管苗的根尖比根段和嫩葉更易誘導胚性愈傷組織。這可能與外植體的生理狀態和其響應誘導條件的程度有關,細胞分裂旺盛、內源激素較多的部位較易獲得胚性愈傷組織[23]。大蒜外植體的選擇受其生育期影響較大,由于蒜薹的抽薹期比較短,所以在大蒜抽薹后,可以取大量花序軸用于胚性愈傷組織的誘導。當收獲大蒜鱗莖后,則可以用鱗莖盤誘導胚性愈傷組織。然而,隨著貯藏時間的延長,蒜瓣中的營養物質會不斷被消耗,鱗莖盤也隨之越來越薄,但發芽葉卻在蒜瓣貯藏過程中不斷形成,此時可以用發芽葉基替代鱗莖盤誘導胚性愈傷組織。雖然蒜瓣和氣生鱗莖的無菌試管苗根尖均有較高的胚性愈傷組織誘導率,但其還需經過試管苗的誘導,步驟較繁瑣,而且根尖本身比較小,誘導形成的胚性愈傷組織相對較少。綜合分析認為,花序軸、鱗莖盤和發芽葉基更適合作為誘導大蒜胚性愈傷組織的外植體。

形態學結合組織學和超微結構特征觀察能對體細胞胚發生過程的研究更全面。體細胞胚間接發生途徑通常包含愈傷組織誘導、胚性愈傷組織轉化、體細胞胚形成和發育、體細胞胚成苗等過程[28]。以大蒜花序軸為外植體,根據形態和組織學特征,本研究將體細胞胚發生早期過程劃分為外植體、愈傷組織、初期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚5個階段。通過觀察發現,大蒜愈傷組織呈半透明狀態,表面不光滑,組成愈傷組織的細胞為典型的薄壁細胞,符合愈傷組織的特點。大蒜胚性愈傷組織在外觀形態上呈顆粒狀,表面光滑,易與愈傷組織區分,與Fereol等[24]和程雅琪[17]所觀察到的大蒜胚性愈傷組織及與Ramakrishnan等[29]和Wu等[30]所觀察到的洋蔥胚性愈傷組織形態結果一致。本研究把胚性愈傷組織分為初期胚性愈傷組織和后期胚性愈傷組織兩個階段,石蠟切片和超微切片結果表明,初期胚性愈傷組織細胞核大而明顯,細胞器較豐富,出現較多的小液泡,局部有胞間連絲分布,與小麥[31]、棉花[32]和石刁柏[33]胚性細胞超微特征類似,豐富的細胞器有利于活躍的細胞代謝,胞間連絲在植物細胞發育、物質運輸和信號傳導中發揮重要作用。后期胚性愈傷組織存在細胞核向一端偏移的現象,這些細胞可能之后會進行不對稱分裂,分裂為頂細胞和基細胞,但它們都承襲胚性細胞的胚性[34]。球形胚具有大的細胞核,存在較多小液泡,細胞質濃稠且有前質體和較多線粒體的分布,可為體細胞胚的進一步分裂與分化奠定基礎。植物體細胞胚發生過程與其合子胚發生類似,雙子葉植物體細胞胚發生大致經歷原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉形胚階段。單子葉植物只有一片子葉,在球形胚之后,一般不再形成心形胚和魚雷形胚,但不同種類單子葉植物具有各自的發育特征,如唐菖蒲[35]、菠蘿[36]和白鶴芋[37],其體細胞胚發育過程也有差異。本研究觀察到大蒜球形胚可以繼續發育形成梨形胚和子葉形胚,最后萌發成具有根和葉的完整植株。

4 結 論

大蒜花序軸、鱗莖盤、發芽葉基均為誘導大蒜胚性愈傷組織的適宜外植體,用于胚性愈傷組織誘導的最適宜2,4-D質量濃度分別為3.0、2.0、2.0和3.0 mg/L,誘導率分別為82.22%、 89.21%、82.52%和83.40%。在2,4-D 0.25 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L條件下,體細胞胚的萌發系數最高,達35.56個/g。以花序軸為外植體,根據形態和組織學特征,可將大蒜體細胞胚發生早期過程劃分為外植體、愈傷組織、初期胚性愈傷組織、后期胚性愈傷組織和球形胚5個階段,各階段具有各自典型特征。球形胚可繼續發育形成梨形胚、子葉形胚,最后萌發成小植株。由大蒜體細胞胚萌發形成的植株,培養90 d后可形成試管鱗莖,將其播種在由草炭、珍珠巖、蛭石按2∶1∶1體積比配制的復合基質中,試管鱗莖的萌發率為70.73%,試管鱗莖苗的成活率達96.55%。