無糖組培條件下獼猴桃莖尖快速生根試驗

王中月,王 健,張阿玲,劉艷飛,劉占德

(西北農林科技大學 園藝學院,陜西楊凌 712100)

中國作為獼猴桃的原產地,栽培面積和產量均位于世界第一[1]。獼猴桃因其營養價值高,風味佳深受消費者喜愛,市場對獼猴桃的需求量也日益增加,因此擴大獼猴桃優質苗木生產迫在眉睫[2-3]。近些年,組織培養快繁技術成為獼猴桃良種繁育的重要途徑[4],然而組織培養中蔗糖的使用會大幅增加組培苗的污染率[5],且密閉的培養環境也不利組培苗生根[2]。因此,生產中急需一種技術解決上述難題。

無糖組培快繁技術是日本千葉大學古在豐樹教授在20世紀80年代末發明的一種全新植物組織培養技術[6-10],是環境調控技術和組織培養技術的結合[11-14],其原理是以CO2代替糖類作為植物的碳源,通過調節培養容器內的微環境使植物進行光合作用,進而促進植物快速生根和生長[15-21]。中國自1994年引進無糖組培快繁技術以來,相繼應用在非洲菊[12]、滿天星[15]、薄葉金花茶[18]、歐李[19]、半夏[20]、金線蓮和鐵皮石斛[21]等植物上。而關于無糖組培快繁技術在獼猴桃種苗繁育方面的應用尚未見報道。

因此,本研究通過比較分析無糖組培和傳統有糖組培方式對獼猴桃莖尖生根效率的影響,并初步探究了不同條件下根系相關酶活、內源激素的變化,以期為構建獼猴桃無糖組培快繁技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以苗齡為6周,生長健壯、長勢相近的中華獼猴桃‘臍紅’和美味獼猴桃‘郁香’組培苗為試材。

1.2 試驗處理

1.2.1 最佳基質含水量篩選 將試材分別接種至含水量為50%、60%、70%、80%、90%的蛭石基質(450 g蛭石+1/2 MS+1.0 mg/L IBA)中培養。每個處理設置3個重復,每個重復30株苗。培養28 d后統計并記錄幼苗的株高、莖粗、葉綠素含量、根數、平均根長、根表面積、根體積等生長指標。

1.2.2 最佳CO2濃度和換氣方式篩選 將試材置于光自養快繁裝置中進行CO2富集培養,通過控制器將CO2濃度設置為800和1 200 μmol/mol,換氣方式設置為自然換氣、間隔15 min強制換氣和間隔30 min強制換氣。每個處理設置3個重復,每個重復30株苗。培養28 d后統計相關生長指標,同“1.2.1”。

1.2.3 無糖組培和有糖組培對比試驗 將試材分別接種在傳統有糖培養基(1/2 MS+25 g/L蔗糖+6.8 g/L瓊脂+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L IAA,pH=5.8)和無糖培養基(450 g蛭石+1/2 MS+1.0 mg/L IBA,pH = 5.8)中培養。每個處理設置3個重復,每個重復30株苗。

光自養無糖組培快繁裝置購于上海離草科技有限公司,培養前期通氣流量為1.0 ± 0.2 L/min,生根培養后期,通氣流量為2.0 ± 0.2 L/min。其他培養條件均相同:光周期為14 h/10 h(光/暗),光照度為2 500～3 000 lx;培養溫度為(24±2) ℃。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 獼猴桃根系指標的測定 生根培養28 d后隨機選取30株幼苗進行根系構型相關參數的測定。取幼苗根部,清洗干凈后于水中展開,用ScanMakeri 800 plus掃描儀獲取根系掃描圖像,利用Win RHIZO軟件對幼苗根系長度、表面積、體積、根尖數、直徑等參數進行分析[5]。

1.3.2 獼猴桃生根過程中相關酶活性及內源激素的測定 分別于生根培養的第1、4、7、14、21、28天進行隨機取樣,用純水清洗干凈擦干后分別將葉片、莖基部擦干后放入液氮速凍,于-80 ℃超低溫冰箱保存,用于相關酶活性及內源激素的測定。

POD、PPO和IAAO活性參照文獻[22-23]的方法進行測定。相關內源激素參照文獻 [24-25]的方法提取,采用超高效液相串聯質譜法(UHPLC-MS)測定。

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2019對試驗數據進行整理和作圖,用SPSS 21.0軟件,采用獨立樣本T檢驗方法、one-way ANOVA方法和LSD多重比較(P<0.05)對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同基質含水量對無糖組培獼猴桃幼苗生長的影響

基質作為植物生長的支撐材料,不僅起固定作用,而且與植物吸收水分和養分、根系呼吸等生理反應密切相關。只有基質滿足根系對水分的需求,才能讓幼苗根系發達。由表1可知,‘郁香’和‘臍紅’在含水量為70%、80%和90%的基質中生根率、存活率等生長指標顯著優于含水量為50%和60%的基質,說明基質含水量對無糖組培苗不定根的形成至關重要。當基質含水量為80%時‘郁香’和‘臍紅’的生根率最高,分別為81.48%和81.67 %;當基質含水量為70%時‘郁香’和‘臍紅’的成活率最高,分別為96.30%和 92.59%。而‘郁香’和‘臍紅’的株高、莖粗及葉綠素含量在基質含水量為70%、80%和90%的處理間沒有顯著性差異(表1)。

表1 不同基質含水量處理下獼猴桃幼苗生長情況Table 1 Effects of different substrate water content on growth of kiwifruit seedlings

2.2 CO2濃度及換氣方式對無糖組培獼猴桃幼苗生長的影響

由表2可知,在800和1 200 μmol/mol 的處理條件下,2個品種生根率并無明顯差異,因此從節約成本的角度考慮,選擇800 μmol/mol較為合理。在相同CO2濃度中,隨著換氣間隔時間的增加,無糖組培苗生根率呈下降趨勢,說明在保證幼苗正常生長的前提下,縮短強制換氣的時間間隔有助于提高2個品種的生根率。2個品種在強制換氣處理下的生根率都極顯著高于自然換氣處理,且間隔15 min強制換氣的生根率最高(‘臍紅’為86.11%,‘郁香’為77.78%)。說明強制換氣能夠增加無糖組培苗的生根率。存活率、株高、莖粗、葉綠素含量在不同 CO2濃度及換氣方式處理間差異不明顯。

表2 不同CO2濃度和換氣方式下獼猴桃幼苗生長Table 2 Effects of CO2 concentration and ventilation mode on growth of kiwifruit seedlings

2.3 無糖組培方式對獼猴桃莖尖生根的影響

由表3可知,2種生根培養方式對獼猴桃組培苗根系的各指標有不同影響。整體來看,‘郁香’和‘臍紅’通過無糖組培的生根效果明顯好于作為對照的傳統有糖組培。無糖組培條件下,‘臍紅’和‘郁香’在培養第7天已形成少量根系,而此時在對照有糖組培中只在莖尖基部形成少量愈傷組織(圖1-A,1-B)。在培養第14天,無糖組培條件下的‘臍紅’和‘郁香’根系快速增長,形成大量次級根,而對照僅形成極少量根系且幾乎無側根。培養第28天,無糖組培條件的2個品種均已形成完整的根系,利于吸收營養對移栽馴化有積極作用,而對照僅有少量根系和極少量側根;且無糖組培條件下‘郁香’和‘臍紅’的總根長、總根表面積、根尖數、分支數均極顯著高于對照,總根體積顯著高于對照(表3);但平均根系直徑極顯著低于對照有糖組培。

圖1 2種組培生根方式下‘郁香’和‘臍紅’根系發育情況Fig.1 Rooting development of ‘Yuxiang’ and ‘Qihong’ under two rooting methods of tissue culture

2.4 無糖組培生根過程中3種抗氧化酶活性的動態變化

由圖2-A可知,無糖組培‘郁香’的POD活性呈先升高再下降的趨勢;而在常規有糖組培的POD活性變化相反。‘郁香’在無糖培養生根的第4天和第7 天,POD活性分別為30.71和 23.48 U/(g· min),極顯著高于對照13.31和3.90 U/(g· min)。由圖2-B可知,‘臍紅’組培苗在生根過程中,無糖組培和傳統有糖組培的POD活性變化趨勢相似,呈現“上升-下降”的單峰趨勢。‘臍紅’在生根培養的第7天,POD活性達104.55 U/(g· min),極顯著高于對照85.56 U/(g· min)。說明生根過程中,較高POD活性有利不定根形成。

* 表示差異顯著(P<0.05),** 表示差異極顯著(P<0.01)。下同

‘郁香’在無糖組培生根的第1天和第4天,PPO活性顯著高于對照,分別是對照的2.64和3.23倍。表明在生根初期,PPO活性高利于產生不定根。在2種生根條件下,‘臍紅’PPO活性在第4天時均達到最高,但二者無顯著性差異(圖 2-C,2-D)。

無糖組培生根第7天時(圖2-E,2-F),‘郁香’和‘臍紅’的IAAO活性均為最高,分別為 15.27和31.63 U/(g·min),分別顯著高于對照的6.33和8.87 U/(g· min)。說明IAAO活性的增加利于不定根的伸長。

2.5 無糖組培生根過程中相關內源激素的動態變化

‘郁香’和‘臍紅’在2種生根方式培養的過程中IAA含量總體呈先降低后升高的“V”形變化趨勢(圖3-A,3-B)。無糖組培的第1天,‘郁香’和‘臍紅’的IAA含量最高,分別為6.84和7.45 ng/g,均顯著高于對照;隨后逐漸下降直到第14天時,達到最低值1.29和1.01 ng/g,且顯著低于對照;之后逐漸升高,到第28天時顯著高于對照。結果說明生根前期,IAA含量高利于不定根 形成。

圖3 無糖組培生根過程中幼苗IAA、ABA和GA3含量變化Fig.3 Changes of IAA,ABA and GA3 contents in seedlings during rooting in sugar-free tissue culture

‘郁香’和‘臍紅’在2種生根方式培養的過程中ABA含量總體上呈先升高后降低的趨勢(圖3-C,3-D)。二者均在無糖組培的第7天ABA含量最高且極顯著高于對照;且‘郁香’在第14天和第21天時,ABA含量仍極顯著高于對照;而‘臍紅’在第14天和第28天時,ABA含量也極顯著高于對照。說明生根中期,高濃度ABA有利于不定根的伸長。

由圖3-E、3-F可知,無糖組培條件下,‘郁香’在第4天時GA3顯著高于對照,第7天時含量達到最高,但與對照相比無顯著性差異。而‘臍紅’除了第4天,無糖組培條件下的GA3含量始終顯著高于對照,且在第14天時含量最高,達到 100.46 ng/g。表明生根后期,高濃度GA3促進不定根伸長和側根形成。

3 討論與結論

植物生根率與基質含水量密切相關,不定根形成時期的基質含水量應維持在70%～80%,這樣既能滿足根系對水分的需求又不易導致其腐爛[23]。本試驗無糖組培條件下基質含水量為80%,獼猴桃組培苗的根系生長良好(表1)。有糖組培生根采用瓊脂作為支撐材料,其凝固后結構致密,通透性差,故根系形態發育受阻;而無糖組培使用疏松多孔的蛭石,有助于幼苗根系的伸展,同時搭配強制換氣利于根系的呼吸作用,這與蘋果[5]和茶[8]的無糖組培生根研究結果相一致。

研究表明,提高培養容器內氣體交換頻率,可以改善馬鈴薯[26]和桉樹[27]的氣孔功能,提高其存活率與生根率,有利于不定根的形成和發育[11]。在本試驗中,獼猴桃無糖組培生根過程中,CO2富集和強制換氣組合的生根效果顯著好于自然換氣。可能由于強制換氣改善了內部氣體環境,影響了組培苗生理代謝從而誘導不定根快速表達。因品種基因型不同,‘郁香’和‘臍紅’組培苗對于CO2濃度和強制換氣時間的適應存在一定差異。

POD被認為與不定根的形成發育密切相關[28]。本研究中,無糖組培條件下‘郁香’和‘臍紅’分別在根系快速產生的第7天和第14天時,POD活性達到高峰且顯著高于對照(圖1-A、圖1-B,圖2),說明無糖組培誘導獼猴桃莖尖快速生根可能與此時POD活性較高有關[29],而POD活性峰值出現時間有所差異可能與品種有關。PPO能催化酚類物質且與IAA形成一種生根輔助因子“IAA-酚酸復合物”[30]。無糖組培條件下,‘郁香’和‘臍紅’的PPO活性分別在第1天和第4天時最高[7.33和10.09 U/(g·min)],因而PPO可能參與誘導培養初期獼猴桃莖尖不定根的形成[31]。在本試驗生根培養第7天,無糖組培條件下的‘臍紅’和‘郁香’IAAO活性均達到最高峰且顯著高于對照(圖2),說明IAAO活性的增強利于不定根形成。此后IAAO活性一直保持較低水平,這與前人研究的生根后期IAAO活性降低促進不定根快速伸長的結果相一致[30,32]。

研究表明,相比傳統有糖組培,植物在無糖組培條件下會產生更多的內源激素[7]。研究發現,千年桐、月季、納塔櫟進行嫩枝扦插時,生根中期IAA含量快速下降,待不定根伸長時其含量緩慢增加,并逐步接近扦插初期水平,這與本試驗的IAA變化規律高度一致,說明生根前期較高濃度的IAA能夠促進根原基形成,后期高濃度IAA促進不定根的伸長。ABA可促進細胞分裂或與其他激素相互作用,從而刺激某些植物插穗生根[33-35]。周幼成[36]研究發現,ABA能夠誘導氣孔關閉,降低蒸騰作用從而減少水分流失。在無糖組培第7天增加了強制換氣的流量,‘臍紅’和‘郁香’為更好保護自身,利用ABA調節氣孔關閉,這解釋了ABA含量激增的緣故。同時內源ABA含量的增加,可以提高根系的吸水性和溢泌速率,促進蛋白質合成,增加根冠比[37]。研究發現,內源GA3對無性繁育中不定根的形成因物種而異[38]。在本試驗中,培養至第7天后GA3含量逐步上升,且無糖組培的GA3含量顯著高于有糖組培,推測高濃度的GA3可能有利于不定根的快速伸長以及次級根的形成。

綜上所述,無糖組培能顯著改善獼猴桃無性繁殖的生根效率,提高生根質量。在無糖組培生根過程中內源激素和相關酶活性變化復雜,且共同參與生根機制。本研究建立的新型無糖組培誘導莖尖快速生根技術,為獼猴桃種苗工廠化快速繁育奠定了理論基礎。