三葉青地上部分顯微結構多樣性與總黃酮含量相關性

程薪宇,郭夢橋,王靖茹,徐璐珂,張彩霞,曾 熒,洪森榮

(1.上饒師范學院 生命科學學院,江西上饒 334001; 2.哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院,哈爾濱150025; 3.黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室,哈爾濱 150025;4.贛東北特色植物資源保育與生態修復重點實驗室,江西上饒 334001)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels &Gilg),為葡萄科(Vitaceae),崖爬藤屬,多年生草質藤本植物[1],全草或塊根入藥,具有抗腫瘤[2]、消炎[3]、調節免疫等功效[4],其黃酮類成分具有抗癌作用[5],因而目前對三葉青的研究主要側重于其黃酮類化合物的分離鑒定[6-7]及藥理作用的研究[8-9],總黃酮含量亦成為衡量三葉青種質資源(簡稱“資源”)品質優劣的重要指標之一[10]。對于三葉青種質資源多樣性及品質比較的研究,目前主要涉及分子標記[11-12]、同工酶[13-14]、色譜分析[12]及農藝性狀[15-16]的比較分析等方面,例如朱波等[16]發現三葉青葉與根系的農藝性狀,可作為三葉青種源地初步鑒定的依據。部分研究人員還發現三葉青種源地生境及地理位置與總黃酮含量存在一定相關性,如吉慶勇等[17]發現麗水市不同海拔三葉青總黃酮含量隨海拔升高呈先增高后降低的趨勢。但此類研究通常區域性較強,或僅以根部或少量葉形性狀為依據對少數資源進行比較和鑒別[16,18-19],不能滿足對大量資源同時進行比較和鑒別的需要,且以根部性狀為鑒別依據,會對植株造成嚴重損傷,不利于資源的保存,甚至可能影響育種速度?，F有研究結果顯示,不同區域生長的同一植物,其外形[20-21]及顯微結構[22]常存在較大差異,可作為資源鑒別依據,黃酮類物質的分布和含量亦與顯微結構有關[23]。而對于三葉青資源間地上部分顯微結構是否存在差異,何種性狀適于作為資源間鑒別依據,以及顯微結構對三葉青地上部分總黃酮含量是否具有指示作用,目前均無相關報道。鑒于此,本研究以引自我國12個省(直轄市)的49份三葉青資源為材料,對各資源莖和葉的顯微結構性狀進行統計比較,并與各資源地上部分總黃酮含量進行相關性分析,意在揭示三葉青地上部分顯微結構性狀在三葉青種質資源鑒別中的價值,以及其與種源地位置和總黃酮含量間的關系,為快速培育高黃酮含量的優質三葉青品種提供更為直觀的解剖學判斷依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

為排除三葉青各資源顯微結構性狀是受不同生長環境短期影響所致的可能,以2020年10月29日采集于上饒市紅日農業開發有限公司懷玉山三葉青引種園的49份三葉青種質資源地上部分為研究材料(所有資源均于采集地栽種3 a以上),各資源種源地信息見表1。

表1 三葉青種源地信息Table 1 Rovenance information of T.hemsleyanum Diels &Gilg

1.2 研究方法

1.2.1 切片法及顯微觀察儀器 利用GMA(Glycol methacrylate,乙二醇甲基丙烯酸酯)半薄切片法[24]和徒手切片法對各三葉青資源莖葉顯微結構進行觀察。用Olympus BX53觀察及Olympus DP26照相。

1.2.2 莖顯微結構 選擇各資源5株代表性植株,切取距離莖末端30 cm處莖組織,置于FAA固定液[V(甲醛)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=18∶1∶1]中固定24 h以上,制作徒手切片,觀察并測量莖長軸長度等8個解剖學性狀,并將其轉化為7個比例性狀。

莖解剖學性狀:

莖長軸長度(Length of stem long axis,LSL):莖橫切面長軸長度。

莖短軸長度(Length of stem short axis,LSS):莖橫切面短軸長度。

莖皮層厚度(Stem cortex thickness,SCT):莖長軸兩端表皮與初生韌皮纖維間皮層厚度(取6次測量平均值)。

莖維管束數量(Number of stem vascular bundles,NSB):莖橫切面維管束總數。

莖木質部寬度(Stem xylem width,SXW):莖長軸兩端維管束木質部寬度(取5個以上維管束木質部寬度平均值)。

莖初生韌皮纖維束直徑(Stem primary phloem fiber bundle diameter,SPF):莖長軸兩端6條最粗初生纖維束最大直徑的平均值(取6次測量平均值)。

莖木化細胞層厚度(Thickness of stem lignified cell layer,TSL):莖短軸束間木化細胞層厚度(取6次測量平均值)。

莖長軸髓部寬度(Width of stem long axis pith,WSL):髓部短軸長度。

莖比例性狀:

莖長寬比(LSL/LSS):莖長軸長度/莖短軸長度。

莖皮層比(SCT/LSL):莖皮層厚度/莖長軸長度。

莖維系數(NSB/LSL):莖維管束數量/莖長軸長度。

莖韌纖比(SPF/LSL):莖初生韌皮纖維束直徑/莖長軸長度。

莖維寬比(SXW/LSS):莖木質部寬度/莖短軸長度。

莖木比(TSL/LSS):莖木化細胞層厚度/莖短軸長度。

莖髓寬比(WSL/LSL):莖長軸髓部寬度/莖長軸長度。

1.2.3 葉顯微結構 選擇各資源5株代表性植株,采集其上完全伸展葉為材料,截取葉柄及中裂片中央區域為材料,置于FAA固定液中固定24 h以上,制作徒手切片,觀察并測量氣孔密度等11個葉解剖學性狀,并將其轉化為9個比例性狀,氣孔密度為重復觀察3個植株葉片所得。

葉解剖學性狀:

氣孔密度(Stomatal density,SD):1 mm2內氣孔數量(取3次觀測結果平均值)。

柵欄組織厚度(Palisade tissue thickness,PTT):葉上表皮與海綿組織間距離。

海綿組織厚度(Spongy tissue thickness,STT):葉下表皮與柵欄組織間距離。

葉柄高度(Petiole height,PH):葉柄橫切面近軸面至遠軸面間距離(不含翅)。

葉柄寬度(Petiole width,PW):葉柄橫切面兩側面間距離。

葉柄翅長度(Petiole wing length,PWL):翅末端至兩翅基部連線的垂直距離。

葉柄翅間距(Distance between petiole wings,DPW):葉柄兩翅末端間距離。

葉柄皮層厚度(Petiole cortex thickness,PCT):葉柄遠軸面中央點距離其上方維管束形成層的距離。

葉柄髓寬度(Petiole pith width,PPW):葉柄中央髓部兩側面間距離。

葉柄髓高度(Petiole pith height,PPH):葉柄中央髓部近軸面至遠軸面間距離。

葉柄維管束數量(Number of petiole vascular bundles,NPV):葉柄橫切面中維管束數量。

葉比例性狀:

柵海比(PTT/STT):柵欄組織厚度/海綿組織厚度。

柄高寬比(PH/PW):葉柄高度/葉柄寬度。

柄翅高比(PWL/PH):葉柄翅長度/葉柄高度。

柄翅寬比(DPW/PW):葉柄翅間距/葉柄寬度。

柄皮層比(PCT/PH):葉柄皮層厚度/葉柄 高度。

柄髓寬比(PPW/PW):葉柄髓寬度/葉柄寬度。

柄髓高比(PPH/PH):葉柄髓高度/葉柄高度。

柄髓寬高比(PPW/PPH):葉柄髓寬度/葉柄髓高度。

柄維系數(NPV/PW):葉柄維管束數量/葉柄寬度。

1.2.4 黃酮類化合物組織化學定位 隨機選擇10個三葉青資源,制作三葉青莖、葉柄、葉片徒手切片(取材位置參考“1.2.1”),對NaNO2- Al(NO3)3-NaOH染色法[25]進行改良,使之適用于三葉青徒手切片染色,觀察黃酮類化合物在各組織中的分布情況(圖2-A,2-B,2-C)。徒手切片染色過程如下:(1)將厚度0.9～1.2 mm的徒手切片,置于4 mL心管中。(2)離心管加入2.5 mL 70%乙醇,靜置1 h(等待切片褪色)。(3)向每組離心管中加入 0.2 mL 5%NaNO2水溶液,搖勻,靜置 6 min。(4)向每組離心管中加入 0.2 mL 10% Al(NO3)3水溶液,搖勻,靜置 6 min。(5)向每組離心管中加入 1 mL 10% NaOH水溶液,搖勻,靜置 10 min。(6)制作臨時裝片,置于顯微鏡下觀察,切片中橙紅色顯色細胞記為富含黃酮類化合物的細胞。

1.2.5 總黃酮含量測定 取各資源地上部分鮮樣(含莖、葉),50 ℃烘干72 h以上至恒質量,再將烘干所得干樣粉碎后過100目篩,作為總黃酮檢測樣品。總黃酮含量(Total flavonoids content,TFC)檢測方法參考馬祥等[26],各資源重復測定3次。

1.2.6 統計學分析 利用SPSS 20.0對三葉青莖、葉顯微結構比例性狀和種源地位置及地上部分總黃酮含量進行相關性分析(由于比例性狀較長度性狀穩定,因此均以顯微結構比例性狀為變量進行統計分析)。

2 結果與分析

2.1 三葉青莖顯微結構

三葉青莖橫切面多近橢圓形,稀近圓形,直徑多為1.5～3 mm,較粗時可達3.6 mm,莖長寬比為1.01～1.46,變異系數僅9.07%,其中YNMLP和JXYSH莖長寬比最大,莖橫切面整體較扁。莖表面多平滑,少數資源莖表具棱或翅。莖表皮細胞近橢圓形,外側壁增厚(圖1-A,1-B)。皮層厚度多為150～300 μm,厚時可近500 μm,莖皮層變異系數11.16%(圖1-A,1-B)。外韌維管束呈橢圓形分布于皮層內側,數量多為14～17,稀達25,莖維系數變異系數13.77%,各資源間存在一定差異(圖1-A)。莖長軸兩端維管束(簡稱長軸維管束)較短軸兩端維管束(簡稱短軸維管束)發達,此為莖橫切面呈橢圓形的主要原因,長軸維管束最外側為初生韌皮纖維束,其直徑多為80～120 μm,各資源間莖韌纖比變異系數21.54%,以ZJ-SCH中最為發達(莖韌纖比達20.81),資源間差異較大(圖1-A,1-B)。長軸維管束韌皮部(不包含初生韌皮纖維)厚度多為 60～180 μm,最厚時達約350 μm(圖1-A)。長軸維管束常具1～3層次生韌皮纖維(圖1-A,1-B),木質部長度多在150～400 μm,較厚時可達600 μm以上,莖維寬比變異系數13.18%,表明各資源間維管束發達程度存在一定差異(圖1-A, 1-B)。維管束木質部基部間細胞木化成木化細胞層,木化細胞層厚度多在50～90 μm(圖1-A),莖木比變異系數15.31%,其中江西資源莖木比通常較小,多為0.03左右,湖北的HB-XDS最高,達0.05左右,表明木化細胞層厚度在各資源間存在明顯差異。莖部中央是薄壁細胞組成的髓,莖長軸髓部寬度多在600～1 200 μm(圖1-A),莖髓寬比各資源間變異系數12.45%(表2)。

A、B.莖橫切; C.葉柄橫切; D.葉片橫切; E.氣孔。c.皮層; e.表皮; lcl.木化細胞層; pt.柵欄組織; ph.韌皮部; pi.髓; ppf.初生韌皮纖維; spf.次生韌皮纖維; st.海綿組織; vb.維管束; x.木質部;下同。比例尺:圖A=1 mm; B,C,D=200 μm; E=50 μm

表2 三葉青莖顯微結構比例性狀Table 2 Microstructural roportion haracters of T.hemsleyanum Diels &Gilg Stems

2.2 三葉青葉顯微結構

2.2.1 葉柄顯微結構 三葉青葉柄橫切面近心形,直徑0.8～3.0 mm(不含翅長度),寬度略大于高度或近相等,資源間葉柄高寬比較為相近,變異系數僅4.63%(圖1-C,表3)。葉柄近軸面中央具小凸起,凸起兩側具翅,翅長為0.15～0.85 mm,三葉青各資源葉柄翅相關的比例性狀變化較大,其中柄翅高比變異系數最大,達21.23%,柄翅寬比變異系數次之,達15.92%。葉柄表皮細胞橫切面近橢圓形,外側壁明顯增厚。皮層厚度多為0.15～0.4 mm,較厚時約0.85 mm,各資源間柄皮層比變化較大,變異系數達16.62%(圖1-C,表3)。葉柄多具外韌維管束6～10條,最多時見17條,變異系數11.61%,資源間葉柄維管束數量相對穩定(圖1-C,表3)。較成熟葉片維管束間的皮層內側(維管束間)細胞木化形成木化細胞層,厚度約50 μm。葉柄中央為由較大薄壁細胞組成的髓部,髓部橫切面整體輪廓與葉柄相似,柄髓寬比及柄髓高比多在0.5左右,變異系數均為10.0%左右,資源間差異不大(圖1-C,表3)。

表3 三葉青葉顯微結構比例性狀及地上部分總黃酮含量Table 3 Proportional characters of leaf microstructure and total flavonoids content in aboveground part of T.hemsleyanum Diels &Gilg

2.2.2 葉片顯微結構 葉片上表皮細胞橫切面近橢圓形,厚度約20 μm,下表皮細胞橫切面近橢圓形,較上表皮細胞略小,厚度約15 μm(圖1-D),具無規則型氣孔(圖1-E),氣孔密度變異系數達23.25%,各資源間存在較大差異,本研究涉及資源中GX-YSH氣孔密度最低,僅51.403 mm-2,ZJ-SCH氣孔密度較高,達118.069 mm-2。三葉青葉片柵欄組織厚度多為100～140μm,海綿組織通常較柵欄組織厚,多為120～180 μm,較厚時可達200 μm,柵海比多在0.70～ 0.90,變異系數11.26%,性狀相對穩定,形成層發達(圖1-D)。

2.3 三葉青莖葉間顯微結構相關性分析

基于三葉青莖與葉顯微結構的相關性分析結果可知,部分葉顯微結構與莖顯微結構存在一定的相關性,例如,莖長寬比與葉的柵海比和柄皮層比分別呈顯著和極顯著正相關,相關系數分別為0.336和0.403,即葉片柵欄組織及葉柄皮層發達的資源,其莖較扁。而莖長寬比與柄維系數則呈顯著負相關,相關系數-0.310,即葉柄維管組織發達的資源,其莖整體偏圓;莖韌纖比與半數葉顯微結構性狀存在相關性,其中與氣孔密度呈極顯著正相關,相關系數0.366,與柄高寬比、柄翅寬比和柄維系數呈顯著正相關,相關系數依次為 0.289、0.331和0.308,與柄髓高比呈顯著負相關(相關系數-0.323),即莖中韌皮纖維發達的資源,其葉柄較圓、兩翅相對距離較遠、維管組織發達,而髓部不發達。莖維寬比與柄高寬比和柄皮層比分別呈顯著負相關(相關系數-0.331)和顯著正相關(相關系數-0.304),即莖維管束發達的資源,其葉柄相對較扁、皮層發達。莖髓寬比與柄翅高比和柄翅寬比分別呈顯著(相關系數0.319)和極顯著(相關系數0.414)正相關(表4)。

表4 三葉青莖葉顯微結構相關性分析Table 4 Correlation analysis of microstructure between stems and leaves of T.hemsleyanum Diels &Gilg

2.4 三葉青黃酮類化合物組織化學定位

染色結果顯示,切片中黃酮類化合物呈橙紅色至紅色,莖中顯色細胞最多(圖2-A),其次為葉柄(圖2-B),葉片中最少(圖2-C)。莖及葉柄中黃酮類化合物主要分布于皮層、髓部及韌皮部中,而韌皮纖維、木質部、木化細胞層中無明顯黃酮類化合物分布跡象(圖2-A,2-B)。葉片中黃酮類化合物主要分布于維管束附近及靠近下表皮的海綿組織中,柵欄組織中黃酮類化合物分布相對較少(圖2-C)。

2.5 三葉青顯微結構與種源地相關性分析

三葉青莖葉顯微結構與種源地地理位置相關性分析結果顯示(表5),莖部顯微結構比例性狀中,莖維寬比與種源地緯度及海拔存在相關性,相關系數分別為-0.306和0.376,即伴隨著三葉青種源地的南移和海拔的升高,其維管組織越來越發達。

表5 三葉青顯微結構與種源地及總黃酮含量相關性分析Table 5 Correlation analysis of microstructure with provenance and total flavonoids content of Tetrastigma hemsleyanum

部分葉柄顯微結構比例性狀與種源地地理位置存在相關性,其中柄翅高比和柄翅寬比與種源地緯度呈極顯著正相關(相關系數0.368)和顯著正相關(相關系數0.356)關系,柄皮層比與種源地緯度呈極顯著負相關(相關系數-0.397),即隨著種源地的南移,葉柄腹面的兩翅逐漸變得不明顯,但皮層卻更為發達。氣孔密度、柄翅寬比和柄髓高比與種源地經度存在極顯著或顯著的相關性(相關系數分別為0.647、0.309、-0.299),及隨著種源地由東向西推移,葉氣孔密度降低,葉柄兩翅逐漸靠近,髓部更為發達。

2.6 三葉青顯微結構與總黃酮含量相關性分析

研究結果顯示,三葉青各資源間地上部分總黃酮含量存在較大差異,變異系數達31.89%,其中,云南的YN-MLP總黃酮含量最低,僅16.66 mg/g,浙江的ZJ-WZH最高,達到74.64 mg/g,是YN-MLP的4.6倍(表2)。三葉青地上部分顯微結構比例性狀與總黃酮含量進行相關性分析結果顯示(表5),三葉青總黃酮含量與葉比例性狀無顯著相關性,但與部分莖部比例性狀卻存在極顯著的相關性,例如莖長寬比(相關系數 -0.371)、莖皮層比(相關系數0.370)、莖韌纖比(相關系數0.494)、莖木比(相關系數0.365)。總體而言,即莖較圓、皮層、韌皮纖維、木化細胞層發達的三葉青資源,其地上部分總黃酮含量相對 較高。

3 討 論

現有研究結果顯示,顯微結構可作為部分植物種間[27]或品種間[28]的鑒別依據。本研究結果顯示,三葉青葉柄翅高比、柄翅寬比、柄皮層比和氣孔密度,以及莖部的莖韌纖比和莖木比變異系數均大于15.00%,表明此類性狀在各資源間存在較大差異,可作為種質資源鑒定的參考依據,其中柄翅高比、氣孔密度和莖韌纖比變異系數均大于20.00%,在三葉青種質資源鑒定過程中,可能具有更高的參考價值。而從實用角度出發,柄翅高比、柄翅寬比不僅限于解剖學手段觀察,更能用肉眼直接進行初步判斷,較為直觀,在種質資源鑒別上可能具有更高的實用性。

葛楚源等[23]利用NaOH顯色法,觀察到草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]黃酮類化合物主要分布在葉中的厚角組織、柵欄組織、維管束、分泌細胞中,莖中僅表皮、厚角組織、韌皮部和分泌細胞出現顯色反應,莖皮層和髓部顯色反應不明顯。而三葉青黃酮類化合物組織化學定位染色結果顯示,三葉青地上部分黃酮類化合物主要分布于莖皮層、韌皮部、髓部等薄壁組織中,葉中顯色細胞相對較少,主要發生在靠近下表皮的海綿組織及維管束周圍的薄壁組織中,即三葉青地上部分黃酮類化合物主要集中于莖部,這與洪春桃等[29]報道的三葉青莖中總黃酮含量大于葉,甚至嫩莖的總黃酮含量亦顯著大于老葉的結論一致,為其提供了解剖學證據,同時也表明黃酮類化合物在植物中的分布位置可作為物種間鑒別的依據。

有報道指出,植物顯微結構與代謝產物含量間存在一定的相關性[30]。本研究相關性分析結果顯示,三葉青莖長寬比、莖皮層比、莖韌纖比和莖木比與三葉青地上部分總黃酮含量存在極顯著的相關性,其中各資源間莖韌纖比和莖木比變異系數較大,這表明莖韌纖比和莖木比等莖比例性狀可作為三葉青種質資源鑒別的重要依據,同時,對篩選高黃酮三葉青種質資源及品種亦有一定的指示作用。

雖然三葉青地上部分黃酮類物質主要集中于莖部,且本研究結果表明可依據莖部外形及莖韌纖比和莖木比對三葉青各資源間總黃酮含量的相對高低進行初步判斷,但在實際生產中,如果僅使用莖顯微結構作為高黃酮三葉青品種篩選依據,有時可能會受限于材料數量,而導致無法實施。鑒于此,認為雖然葉顯微結構與三葉青地上部分總黃酮含量無顯著相關性,但其部分性狀卻與莖顯微結構性狀具有顯著或極顯著的相關性,在莖部材料不便用于資源間差異分析時,也可將柄翅寬比或柄維系數等葉顯微結構性狀作為三葉青高黃酮資源的傾向性篩選依據。

莖葉顯微結構比例性狀與種源地地理位置相關性分析結果顯示,葉顯微結構比例性狀中有半數性狀與種源地緯度或經度存在顯著或極顯著的相關性,而莖部顯微結構比例性狀中,除莖維寬比與種源地緯度和海拔存在顯著和極顯著相關性外,其他性狀與種源地位置無顯著相關性,這表明三葉青各種源地資源葉顯微結構的差異可能主要受大氣候環境因素影響所致,而莖部顯微結構及黃酮含量差異[17]的形成,則可能更多的是受大氣候之外的環境因素影響所致。