光核桃AmSO基因初克隆及生物信息學(xué)分析

鮑 馨,李建欣,孟凡娟

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150040)

光核桃(Amygdalusmira)是薔薇科桃屬植物,是極其罕見的“活化石群”,同時(shí)也是中國二級保護(hù)植物。它屬于落葉喬木,樹干龐大,壽命可達(dá)數(shù)千年,這是世界上較為稀有的桃種質(zhì)資源[1]。光核桃通常生長在海拔2600m～4200m,主要分布在雅魯藏布江下游、尼洋河和帕隆藏布江流域[2]。光核桃生長速度快、自然更新能力強(qiáng)、適應(yīng)能力極強(qiáng)。光核桃具有抗旱性[3]、抗寒性[4]、遺傳多樣性高的特點(diǎn),是篩選抗旱、抗寒等性狀的優(yōu)良桃樹資源。目前,對光核桃的研究多集中在其生理特征[3,5]、生物遺傳多樣性[6-8]及加工利用[9-11]等方面。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

光核桃種子由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,種子于2021年1月4 ℃春化處理,同年3月在黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)溫室(25 ℃左右)內(nèi)播種,萌發(fā)后移栽至直徑 21 cm、深25 cm并且盆底有排水孔的花盆中,土壤體積比例為花神土∶蛭石=3∶1,選取3月齡光核桃頂端幼嫩葉片,液氮速凍,于-80 ℃冰箱保存,備用;大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)由東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)試劑

Gel Extraction Kit(康為世紀(jì)生物科技有限公司)、Plant RNA simple Total RNA Kit(康為世紀(jì)生物科技有限公司)、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)、2×Phanta Max Master Mix(Vazyme)、rTaq(TaKaRa)、dNTP Mix(TaKaRa)、10×LA PCR Buffer Ⅱ(TaKaRa)、氨芐青霉素(Amp)、瓊脂粉、胰蛋白胨、1 mmol/L NaOH、NaCl、酵母提取物等。

1.3 光核桃AmSO基因初克隆

1.3.1 光核桃AmSO基因引物設(shè)計(jì)與合成 光核桃與碧桃(Prunuspersica)同屬于桃屬,親緣關(guān)系較近,因此推斷二者SO基因序列相似度較高。根據(jù)GenBank中碧桃PpSO基因序列信息,運(yùn)用Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列如下:AmSO-F:ATGCCTGGCGTCAGAGGG;AmSO-R:CTACAAATTCGAGTGACCAACT CGAAC,引物由吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.3.2 光核桃總RNA的提取及cDNA的合成 取幼嫩葉片0.1 g,于液氮中充分研磨,按照Plant RNA simple Total RNA Kit操作說明書,提取光核桃葉片總RNA,加入適量DEPC水充分溶解,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,NanoDrop分光光度計(jì)測定RNA樣品濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA主要步驟如下:取2 μL 4×DN Master Mix和1 μg變性的總RNA于200 μL PCR管中,加入Nuclease-free water補(bǔ)齊至8 μL,充分混勻離心,37 ℃溫育5 min,所得 8 μL DNA消化液中加入2 μL 5×RT mmⅡ, 37 ℃孵育15 min后;立即50 ℃水浴5 min, 98 ℃水浴5 min使酶失活,反應(yīng)后的產(chǎn)物即為cDNA的第一鏈。

1.3.3 光核桃AmSO基因cDNA克隆 以光核桃cDNA為模板,通過PCR擴(kuò)增包含光核桃AmSO基因全部編碼區(qū)的cDNA序列。PCR擴(kuò)增體系為2 μL cDNA、1.5 μL AmSO-F、1.5 μL AmSO-R、15 μL 2×Phanta Max Master Mix、10 μL ddH2O共30 μL,PCR擴(kuò)增程序: 95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s,58 ℃退火 15 s,72 ℃延伸90 s,共35 個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min;溫度降至10 ℃保存。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的片段大小一致且單一的條帶,利用Gel Extraction Kit試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。膠回收產(chǎn)物加PolyA尾,反應(yīng)體系為:7 μL膠回收產(chǎn)物、2 μL 10×LA PCR Buffer Ⅱ、0.8 μL dNTP Mix、0.2 μL rTaq共10 μL,72 ℃水浴30 min,反應(yīng)結(jié)束后取出置于冰上,將4 μL連接PolyA尾的目的基因片段、1 μL pMD18-T載體及 5 μL Solution Ⅰ混合溶液4 ℃過夜;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)中。主要操作步驟參照唯地生物大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)說明書,次日挑取單菌落進(jìn)行PCR陽性克隆檢測,最后挑選無雜帶、目的基因片段大小正確的陽性克隆菌落送樣測序,測序由睿博興科生物技術(shù)有限公司哈爾濱分公司完成,完成后進(jìn)行序列比對。

1.4 光核桃AmSO基因生物信息學(xué)分析

1.4.1 AmSO蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 利用在線分析網(wǎng)站ExPASy(https://www.expasy.org/)中ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對光核桃AmSO蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸組成以及不穩(wěn)定系數(shù)等多種理化性質(zhì)參數(shù)進(jìn)行分析,并利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線分析軟件,通過Hphob./Kyte &Doolittle算法對光核桃AmSO蛋白的親疏水性進(jìn)行分析。利用在線分析軟件EMBL-EBI中的Search Pfam工具(http://pfam.xfam.org/search/sequence)對光核桃AmSO蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。

1.4.2 氨基酸序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 通過DANMAN 8.0軟件將光核桃AmSO基因的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列,再利用NCBI中BLAST對該基因的編碼氨基酸序列進(jìn)行同源性比對,并選擇DANMAN 8.0中Sequence-Aligment-Multiple aligment sequence進(jìn)行多序列氨基酸比對分析;同時(shí)使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,選擇Construct/Test Neighbor-Joining Tree,Bootstrap Replications自檢舉 1 000次。

1.4.3 AmSO蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 運(yùn)用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.htmL)在線分析網(wǎng)站對光核桃AmSO蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;使用Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)在線分析軟件,運(yùn)用同源建模法(Homolog Modeling)對光核桃AmSO蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測以及建立三級結(jié)構(gòu)模型。

1.4.4 AmSO蛋白質(zhì)信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測 運(yùn)用SignalP-4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)在線分析網(wǎng)站對光核桃AmSO蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測,主要使用嵌套交叉驗(yàn)證方法完成。利用ExPASy中的TMpred(http://sbcb.bioch.ox.ac.uk/TM_noj/TM_noj.htmL)在線分析軟件預(yù)測光核桃AmSO蛋白的跨膜區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 光核桃AmSO基因初克隆

運(yùn)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,以光核桃cDNA為模板對光核桃AmSO基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得一條長度1 182 bp的明亮的特異性條帶(圖1),與預(yù)期大小相符。

圖1 AmSO基因的克隆Fig.1 Cloning of AmSO gene

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 AmSO蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 由表1可以看出,AmSO蛋白由1 940 個(gè)C、3 036 個(gè)H、540 個(gè)H、571 個(gè)O、12 個(gè)S原子組成,其分子式為C1940H3036N540O571S12,共有393個(gè)氨基酸,相對分子質(zhì)量為43.45 ku,該蛋白的等電點(diǎn)為8.44,脂肪族氨基酸指數(shù)為82.54,AmSO蛋白的平均親水性和不穩(wěn)定系數(shù)分別為-0.327和36.69,表明AmSO是一種穩(wěn)定的親水性蛋白。

表1 AmSO蛋白理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of AmSO protein on physical and chemical properties

通過ExPASy-ProtScale對AmSO蛋白進(jìn)行親疏水性結(jié)構(gòu)域預(yù)測(圖2),結(jié)果進(jìn)一步表明AmSO蛋白為親水性蛋白,并具有29個(gè)親水結(jié)構(gòu)域和30個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域。

圖2 AmSO蛋白親水性和疏水性預(yù)測Fig.2 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of AmSO protein

利用在線分析軟件EMBL-EBI中的Search Pfam工具對光核桃AmSO蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(圖3),在AmSO氨基酸序列N端(第53～236位氨基酸)含有Oxidored molyb(氧化鉬)結(jié)構(gòu)域,該活性位點(diǎn)屬于Ubiquitin superfamily (CL0072),存在于各種氧化還原酶中,此結(jié)構(gòu)域與鉬輔因子結(jié)合;C端(第258～389位氨基酸)含有Mo-co dimer(鉬鈷二聚體)結(jié)構(gòu)域,該活性位點(diǎn)屬于E-set (CL0159),常存在于鉬鈷氧化物還原酶中,它參與二聚體的形成,具有Ig-折疊結(jié)構(gòu)。SO作為鉬酶家族成員之一,對其蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測,可以為探究該蛋白功能提供理論基礎(chǔ)。

圖3 AmSO蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 Prediction of AmSO protein domain

2.2.2 氨基酸序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建光核桃AmSO基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4),便于了解多物種之間的進(jìn)化關(guān)系。選取9個(gè)與光核桃AmSO氨基酸序列同源性較高的物種構(gòu)建進(jìn)化樹,其中碧桃PpSO與光核桃AmSO親緣性最近,擬南芥中AtSO同源基因共有3 個(gè),分別命名為AtSO1、AtSO2、AtSO3,根據(jù)進(jìn)化樹分析可知擬南芥AtSO與光核桃AmSO親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖4 AmSO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of AmSO protein

利用BLAST程序進(jìn)行氨基酸序列同源性的比對分析(圖5),碧桃、扁桃、蘋果、秋子梨、擬南芥、毛果楊等8個(gè)物種與光核桃同源性較高。碧桃PpSO與光核桃AmSO的一致性最高為100%;擬南芥AtSO3與光核桃AmSO的一致性最低為48.09%。結(jié)果表明SO蛋白結(jié)構(gòu)域在多物種之間表現(xiàn)出高度的一致性,進(jìn)化保守性高。

Am. 光核桃 Pp. 碧桃;Pt. 毛果楊;Pd. 扁桃;Md. 蘋果;Mn. 川桑;Pyr. 秋子梨;At. 擬南芥;Rch. 月季。紅色直線(第53～236位氨基酸)部分表示Oxidored molyb;綠色直線(第258～389位氨基酸)部分表示Mo-co dimer

2.2.3 AmSO蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過GOR4對光核桃AmSO蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析(圖6),該蛋白由19.34%的α-螺旋、 26.46%的擴(kuò)展鏈和54.20%的無規(guī)則卷曲組成。

AmSO蛋白共由393個(gè)氨基酸組成,其中α-螺旋(Hh)有76個(gè)位點(diǎn)、擴(kuò)展鏈(Ee)有104個(gè)位點(diǎn)、無規(guī)則卷曲(Cc)有213個(gè)位點(diǎn)。因此,AmSO蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成。

運(yùn)用SWISS-MODEL在線分析軟件對光核桃AmSO蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,預(yù)測出的三級結(jié)構(gòu)模型以PDB序列號為1ogp.1.A,其寡聚狀態(tài)顯示為Homo-dimer,與目標(biāo)序列的一致度為82.70%,符合要求,光核桃AmSO蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖7。此外,QMEAN值為 -0.88,目標(biāo)序列與模板序列的匹配度較好,說明該模型可用于光核桃AmSO蛋白三級結(jié)構(gòu)的分析模型。

2.2.4 AmSO蛋白質(zhì)信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測 利用SignalP-4.0在線軟件對光核桃AmSO蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果如圖8-A所示,原始剪切位點(diǎn)C-score分析AmSO蛋白在22號位置處得分最高為0.109;綜合剪切位點(diǎn)Y-score分析AmSO蛋白在3位置處得分最高為0.113;信號肽S-score分析AmSO蛋白在22號位置處得分最高為0.121;信號肽得分的均值S和最大綜合剪切位點(diǎn)加權(quán)均值D分別是0.120和0.117,該蛋白S和D的值為0.117,均小于標(biāo)準(zhǔn)參數(shù) 0.450,結(jié)果表明光核桃AmSO無信號肽,推測其屬于胞內(nèi)蛋白。

圖8 AmSO蛋白的信號肽(A)和跨膜區(qū)預(yù)測(B)Fig.8 Prediction of AmSO protein signal peptide(A) and transmembrane region(B)

蛋白質(zhì)中的跨膜區(qū)通常與細(xì)胞功能解密相關(guān),通過光核桃AmSO蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果如圖8-B所示,該蛋白具有雙向跨膜能力,不僅具有1個(gè)由內(nèi)向外的不顯著跨膜結(jié)構(gòu)域,位置為115～134 Aa,預(yù)測分?jǐn)?shù)為359(分?jǐn)?shù)大于500為顯著跨膜結(jié)構(gòu)域);而且存在由外向內(nèi)不明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域1個(gè),位置為114～130 Aa,預(yù)測分?jǐn)?shù)為116。以上結(jié)果表明光核桃AmSO蛋白可能作為膜受體或者離子通道蛋白,在細(xì)胞中發(fā)揮作用。

3 結(jié)論與討論

本研究通過分子克隆技術(shù)獲得光核桃AmSO基因完整的CDS區(qū)域,結(jié)果表明光核桃AmSO基因編碼序列全長1 182 bp,編碼393個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為43.45 ku。生物信息學(xué)預(yù)測和分析表明,AmSO蛋白是一種能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的穩(wěn)定堿性親水蛋白,預(yù)測屬于雙向跨膜結(jié)構(gòu)域,具備一個(gè)由內(nèi)向外的不顯著跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)由外向內(nèi)的不顯著跨膜結(jié)構(gòu)域,該蛋白沒有信號肽。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈構(gòu)成,所占比例分別為54.20%、19.34%、26.46%;AmSO蛋白在N端含有與鉬輔因子結(jié)合的氧化鉬結(jié)構(gòu)域,存在于氧化還原酶中;C端含有鉬鈷二聚體結(jié)構(gòu)域,參與二聚體結(jié)合。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明光核桃AmSO與碧桃PpSO親緣性最近;在對光核桃AmSO氨基酸序列與其他植物比對后發(fā)現(xiàn),在進(jìn)化過程中該蛋白結(jié)構(gòu)域具有較高的保守性,可用于和特定的區(qū)域相互作用,以此控制基因的轉(zhuǎn)錄。

目前植物中SO基因的功能主要是利用模式生物擬南芥進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)硫代謝從而正調(diào)控植物耐旱性,但有研究發(fā)現(xiàn)該基因能夠增強(qiáng)植株的抗病性,這也為后續(xù)研究SO功能提供理論依據(jù)和研究新思路。盡管許多SO提高植物的抗逆功能相繼被報(bào)道,但光核桃中AmSO基因氧化解毒機(jī)制與光核桃抗逆性之間的分子機(jī)制尚未研究。因此,通過對光核桃AmSO基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,隨著對SO結(jié)構(gòu)和功能深入研究,可以為進(jìn)一步探究SO在分子水平如何發(fā)揮作用提供理論依據(jù),為探究其脅迫響應(yīng)機(jī)制奠定初步基礎(chǔ)。