口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗安全性和抗體消長規律

王 政，周海娟，旦增卓瑪

（1.西藏自治區獸醫生物藥品制造廠，拉薩 850004；2.西藏蓮莖生物科技有限公司，拉薩 8501414）

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起牛羊等偶蹄動物的一種烈性急性接觸性傳染病，臨床特征以口腔黏膜、四肢下端及乳房等處皮膚形成水皰和爛斑為主［1，2］。FMDV 有7 個血清型，其中A 型和O 型病毒株流行范圍最廣［3］。FMD 主要流行于非洲、亞洲、中東及南美洲等地區，其中泰國、馬來西亞、緬甸、越南和柬埔寨等東南亞國家疫情形勢嚴峻［4］。該病傳染性強且傳播迅速，廣泛流行于世界各地，已嚴重阻礙了畜牧業的發展［5，6］。世界動物衛生組織（WOAH）將FMD 列為A 類動物疫病名單之首，中國也將其列為一類動物疫病［7，8］。接種疫苗是預防和控制FMD 疫病有效的手段［9-12］，疫苗免疫效果是決定FMD 防控成敗的關鍵因素。因此，研究疫苗安全性和抗體消長規律有助于提高疫苗免疫水平，對FMD疫病預防控制具有重要的意義。

本試驗選用口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗對西藏本地山羊及牦牛進行免疫，初步確定了疫苗免疫安全性和抗體消長規律，為FMD 疫苗免疫程序及疫病防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為西藏本地山羊和牦牛，經臨床檢查健康、無臨床疾病癥狀。試驗動物按規范飼養，以配合飼料和青干草為主進行飼喂。

1.2 儀器與試劑

酶標分析儀購于北京普朗新技術有限公司，型號DNM-9602；恒溫培養箱購于上海鴻都科技有限公司，型號SHP-300；高速冷凍離心機購于湖南星科科學儀器有限公司，型號TGL16，其他耗材均為國產。

口蹄疫競爭ELISA 抗體檢測試劑盒購于蘭州獸研生物科技有限公司，批號2021121705。

1.3 方法

1.3.1 免疫前抗體檢測 對145 只山羊、60 頭牦牛進行頸部靜脈采血，注入采血管。2 h 內帶回實驗室，4 ℃10 000 r∕min 離心3 min，分離血清至新EP管中，4 ℃保存，用于口蹄疫抗體檢測。

1.3.2 疫苗安全性試驗 將20 只山羊、10 頭牦牛等同量分為2 組，試驗組和對照組，采用耳標法和涂不同染料法對試驗動物進行雙重標記。試驗組每頭牦牛肌肉注射口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗1 mL，每只山羊肌肉注射口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗0.5 mL；對照組試驗動物不注射口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗。免疫接種后連續觀察14 d 并記錄試驗動物的免疫反應。

1.3.3 免疫試驗 按照口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗說明書，對125 只山羊、50 頭牦牛肌肉注射疫苗。免疫后連續21 d 對試驗動物進行臨床觀察記錄。在免疫21、60、90、120、150、180 d 分別對試驗動物進行頸部靜脈采血，分離血清，4 ℃保存用于口蹄疫抗體檢測。

1.3.4 抗體檢測方法 用樣品稀釋液將待檢血清按1∶2（體積比）稀釋，加入25 μL 血清樣品于包被板樣品孔，再加入25 μL 樣品稀釋液；陰性、陽性標準血清不需要稀釋，在陰性、陽性對照孔內各加入50 μL 陰性、陽性標準血清；酶標對照孔設立2 孔，各加入50 μL 樣品稀釋液。封膜，振蕩混勻，37 ℃孵育60 min。用蒸餾水按1∶20（體積比）稀釋洗滌液。孵育結束，棄掉孔內液體。每孔加入300 μL 洗滌液，洗滌4 次，棄液，在吸水紙上拍干。每孔加入50 μL酶標抗體，封板，37 ℃孵育30 min。包被板洗滌4次，在吸水紙上拍干。每孔加入50 μL 底物溶液，封板，室溫避光孵育15 min。每孔加50 μL 終止液，于450 nm 波長處測定各孔吸光度。

標準樣品判定，陽性對照樣品抑制率（PI）=（1-陽性對照孔吸光度∕酶標對照孔吸光度）×100%，大于60%；陰性對照樣品抑制率（PI）=（1-陰性對照孔吸光度∕酶標對照孔吸光度）×100%，小于40%。

結果判定，樣品抑制率（PI）=（1-待檢樣品吸光度∕酶標對照孔吸光度）×100%，PI＞50%為陽性，PI≤50%為陰性。

1.4 數據分析

采用Excel 2010 軟件中的數據分析功能對試驗動物的血清樣品抗體水平進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 疫苗安全試驗結果

接種口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗的試驗組動物均未出現過敏反應、局部不適等免疫副作用。連續觀察14 d，試驗動物精神狀態良好，食欲及生長發育正常。

2.2 山羊免疫抗體檢測結果

對125 只山羊進行免疫前和免疫后口蹄疫抗體檢測，結果表明，在免疫前125 只山羊均未檢測到口蹄疫O 型、A 型抗體；免疫后山羊檢測到口蹄疫抗體，但隨時間推移，口蹄疫O 型、A 型抗體合格率逐漸下降。在同一時間段內，口蹄疫O 型抗體合格率明顯高于口蹄疫A 型抗體合格率（表1）。

2.3 牦牛免疫抗體檢測結果

對50 頭牦牛進行免疫前和免疫后口蹄疫抗體檢測，結果表明，在免疫前50 頭牦牛均未檢測到口蹄疫O 型、A 型抗體；免疫后試驗牦牛口蹄疫O 型、A型抗體合格率呈下降趨勢，其中免疫21 d 時口蹄疫O 型、A 型抗體合格率最高；免疫60～120 d 抗體合格率呈現平臺期；免疫150 d 口蹄疫A 型抗體合格率快速下降（表2）。

表2 牦牛的FMD 抗體水平檢測結果

3 討論

FMD 是以口腔黏膜、四肢下端及乳房等處皮膚水皰和爛斑為臨床特征的急性接觸性傳染病［1，2］。該病傳染性強且傳播迅速，廣泛流行于世界各地，中國已將該病列為一類動物疫病［3-5］。中國FMD 疫病防控主要策略是免疫控制，疫苗免疫是有效防控FMD 的綜合措施之一［6，7］，因此疫苗免疫效果直接影響著FMD 防控的成敗。《2022 年國家動物疫病免疫技術指南》指出，FMD 免疫效果評估主要以群體免疫抗體合格率為標準，抗體合格率不低于70%，判定為群體免疫合格，故研究疫苗免疫安全性和抗體消長規律對提高群體合格率及FMD 疫病防控尤為重要。

本試驗對145 只山羊、60 頭牦牛進行FMD 抗體檢測。結果表明，試驗動物的FMD 抗體均為陰性，可以用于后續研究。對口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗的安全性進行研究，結果表明，免疫疫苗的試驗動物無免疫副作用，免疫14 d 內均未出現臨床癥狀，表明該疫苗的免疫安全性良好。采用口蹄疫O型、A 型二價滅活疫苗對125 只山羊、50 頭牦牛進行免疫并檢測FMD 抗體，結果顯示，隨著時間推移，試驗動物口蹄疫O 型、A 型抗體合格率呈逐漸下降趨勢，尤其是免疫150 d 后抗體合格率下降較快。這一現象在牦牛的檢測數據上更加明顯，表明FMD 疫苗具有良好的免疫安全性，在動物體內可產生高水平O 型、A 型抗體且維持較長時間。但值得注意的是疫苗免疫150 d 后口蹄疫O 型、A 型抗體水平下降較快，建議此時間段進行第二次疫苗免疫有助于提高群體抗體合格率。