加味二陳湯誘導(dǎo)肺癌A549移植瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

吳國(guó)玉，何粒芳，柯見龍，熊紹權(quán)

（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072）

肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤［1］，其中非小細(xì)胞肺癌是最常見的病理類型。中醫(yī)藥治療肺癌有著扶正抑瘤并且無明顯毒副作用的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌多有痰濕之證，如痰濁滯肺、痰瘀阻肺、痰熱壅肺等［2-3］。有研究認(rèn)為，痰證是肺癌最主要的中醫(yī)證型［4］。臨床常以二陳湯基于理氣化痰理論來治療肺癌，或以該方為基礎(chǔ)方進(jìn)行化裁，對(duì)晚期肺癌具有較好的治療效果［5-6］。因此，本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究加味二陳湯抗腫瘤的效果，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有著十分密切的關(guān)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶高表達(dá)是腫瘤發(fā)生的早期事件［7］；過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，會(huì)損害UPR 機(jī)制，調(diào)控分子伴侶蛋白，而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR 機(jī)制，可啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡信號(hào)，起到逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，增強(qiáng)腫瘤治療的療效［8］。因此，加味二陳湯的抗肺癌作用是否與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑有關(guān)？本研究對(duì)加味二陳湯可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)也做了初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株

SPF 級(jí)雄性BALB/C 裸鼠［四川科倫藥物研究院有限公司，合格證號(hào)：SYXK（川）2013-184］，18 只，5 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（溫度20 ℃、濕度40%）。肺腺癌A549 細(xì)胞株由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

加味二陳湯組方：陳皮15 g，生姜10 g，天南星15 g，甘草5 g，川芎10 g，法半夏10 g，茯苓10 g；藥材由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。將藥物放入砂鍋中，用清水浸泡半小時(shí)以上，煎煮20 min，煎好的藥汁倒入碗中備用，用同樣的方法再煎煮一次，然后將兩次煎液混勻、過濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濃度為4 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ兴幍蛣┝拷M以成人每日常規(guī)劑量為準(zhǔn)，高劑量組以成人每日常規(guī)劑量的2 倍為準(zhǔn)（依據(jù)“人與動(dòng)物體表面積折算表”計(jì)算裸鼠的等效劑量）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

ATF4、CHOP、GAPDH 一抗（Sigma 公司，產(chǎn)品批號(hào)SAB2105294、SAB4500631、G9295）濃度分別為1∶500、1∶500、1∶50 000；水合氯醛（上海凌峰化學(xué)有限公司）；TUNEL 試劑盒（羅氏公司，批號(hào)：11767291910）；SDSPAGE凝膠快速制備試劑盒；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

1.4 實(shí)驗(yàn)器材及耗材

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特公司）；Pipet-Lite XLS + 手動(dòng)單道移液器（RAININ 瑞寧）；AXTDL5M-Ⅱ臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)（鹽城市安信實(shí)驗(yàn)器械有限公司）；水域恒溫振蕩器（上海天進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)biotek 公司）；MILLED 型普通光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

2 方法

2.1 構(gòu)建A549肺腺癌移植瘤裸鼠模型

將DMEM 培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，并將人肺腺癌A549細(xì)胞加入培養(yǎng)液。待A549細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%，按 1∶3 分瓶傳代培養(yǎng)，制備單細(xì)胞懸液。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549肺癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，以臺(tái)盼蘭檢測(cè)確保死細(xì)胞數(shù)＜5%。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，于裸鼠于右腋皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液（接種量1×106個(gè)/mL）。

2.2 分組及給藥

所有裸鼠接種4 d后均成瘤，10 d后裸鼠皮下瘤結(jié)節(jié)達(dá)3～4 mm。將18 只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、加味二陳湯低劑量組（簡(jiǎn)稱中藥低劑量組）、加味二陳湯高劑量組（簡(jiǎn)稱中藥高劑量組），每日灌胃0.2 mL 生理鹽水和13、26 g/（kg·d）二陳湯水煎液，每天1 次，連續(xù)給藥21 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

單細(xì)胞混懸液皮下注射成功后，用游標(biāo)卡尺每隔4 d 測(cè)量裸鼠皮下瘤結(jié)節(jié)，即分別于第1、5、9、13、17、21天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑（a）、短徑（b）。

瘤重：給藥21 d后，處死裸鼠，剝離腫瘤稱取瘤重。

腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組平均瘤重 -治療組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%

腫瘤體積V=1/2×a×b2

2.4 Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

腫瘤組織解凍裂解，離心取上清，提取總蛋白，測(cè)定待測(cè)樣品蛋白濃度，各組蛋白溶液按順序每孔上樣，電泳分離切割目標(biāo)蛋白，將PVDF 膜浸入甲醇中，將目標(biāo)蛋白和PVDF 膜疊放到一起，搖床緩慢搖動(dòng)1 h；加入一抗（ATF4 1∶500；CHOP 1∶500），24 ℃孵育2 h；脫色搖床浸洗，二抗孵育37 ℃孵育；ECL 底物發(fā)光；暗室中曝光，掃描膠片，用凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描分析，以GAPDH內(nèi)參為對(duì)照。

2.5 TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率

將腫瘤組織置入胰蛋白酶K中固定后脫水、包埋、切片，分別加入TUNEL混合液、3號(hào)液反應(yīng)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫脂、封片，每張切片選取5個(gè)400倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。

凋亡率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPrism6.0、SPSS21.0、ImageJ 等軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線、瘤重、抑瘤率的比較

中藥低劑量組和中藥高劑量組裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度、腫瘤體積、瘤重，與對(duì)照組比較均顯著改善。中藥低劑量組與中藥高劑量組抑瘤率分別為21.4%、37%，表明加味二陳湯能明顯抑制A549腫瘤生長(zhǎng)及瘤重，且與劑量存在量效關(guān)系。結(jié)果見圖1和表1。

表1 各組腫瘤體積、腫瘤瘤重、抑瘤率的比較（±s，n =6）

表1 各組腫瘤體積、腫瘤瘤重、抑瘤率的比較（±s，n =6）

注：與中藥低劑量組比較，#P＜0.05；與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組中藥低劑量組中藥高劑量組腫瘤體積/mm3 1 450.90±319.20 1 166.20±363.90 889.60±280.60#瘤重/g 1.03±0.14 0.81±0.09*0.68±0.08*抑瘤率/%0.00 21.40 37.00

圖1 各組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線

3.2 各組小鼠腫瘤凋亡率，ATF4、CHOP 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

中藥高劑量組和中藥低劑量組腫瘤凋亡率，ATF4、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組改善，且中藥高劑量組的改善情況優(yōu)于中藥低劑量組。結(jié)果見表2～3，圖2。

表2 各組腫瘤凋亡率比較（±s）

表2 各組腫瘤凋亡率比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6凋亡率/%23±5 29±5 35±6*

表3 各組ATF4、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組ATF4、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組中藥低劑量組中藥高劑量組CHOP 0.39±0.08 0.53±0.08*0.82±0.09*n6 6 6 ATF4 0.35±0.06 0.52±0.08*0.73±0.06*

圖2 各組ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平

TUNEL 法檢測(cè)裸鼠腫瘤組織，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕色，為陽性細(xì)胞，非凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)色，見圖3。

圖3 各組裸鼠腫瘤組織原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)

4 討論

在肺癌治療中，中醫(yī)藥治療有扶正抑瘤、降低放化療毒副作用、改善患者生活質(zhì)量等優(yōu)勢(shì)［9］。研究證實(shí)，中醫(yī)藥可以通過多種途徑，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，并且可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［10-11］。中晚期肺癌屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛多為氣虛為主，標(biāo)實(shí)以痰濕多見。百病皆因痰起，故肺癌治療中化濕祛痰尤為重要。國(guó)醫(yī)大師周岱翰教授［12］認(rèn)為，癌腫發(fā)生，皆因痰作祟。臨床上肺癌患者痰瘀搏結(jié)則常常表現(xiàn)為咯血胸痛、咳嗽氣促；痰濁蒙蔽清竅則容易發(fā)生肺癌腦轉(zhuǎn)移。諸多研究表明，化痰之品能增加腫瘤細(xì)胞間的黏附能力，抑制腫瘤細(xì)胞向基質(zhì)及血管侵襲，通過影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移［13-14］。

二陳湯常被稱為祛痰之通劑，可通過健脾和胃、理氣以化痰。臨床以二陳湯化裁，治療因“痰”引起的各種病癥，包括肺癌［15-16］。加味二陳湯在原方基礎(chǔ)上加用川芎、天南星和生姜，為治療濕痰流注之主方。該方以半夏、南星為君，化痰散結(jié)；陳皮、川芎理氣化痰；茯苓健脾去濕，濕去則脾旺，脾旺則痰無由以生；炙甘草調(diào)和諸藥，兼潤(rùn)肺和中。全方標(biāo)本兼治，共奏理氣健脾、化痰散結(jié)之功效。有研究報(bào)道，二陳湯聯(lián)合鉑類化療不僅可以直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還可通過干預(yù)VEGF/VEGFR-2 分子影響血管生成因子而間接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［17］。還有研究將二陳湯分別與不同療效的中藥聯(lián)用后發(fā)現(xiàn)，二陳湯可增高脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、外周血細(xì)胞及免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+［18］。林洪生教授［19］認(rèn)為痰與瘀邪毒侵肺是導(dǎo)致癌癥的病理產(chǎn)物，痰瘀互結(jié)，脈絡(luò)瘀阻，血不循經(jīng)從而溢于脈外，肺失宣發(fā)肅降、痰濕阻肺，故臨證可見咳嗽氣促、痰中帶血等，并擅長(zhǎng)使用二陳湯作為底方加減運(yùn)用治療并取得較好效果。二陳湯加減方聯(lián)合鉑類化療可改善患者肺癌相關(guān)癥狀如咳嗽、咯血等，還可以緩解疲倦、失眠、脫發(fā)等其他癥狀，修復(fù)化療引起的免疫損傷［20］。

本研究結(jié)果顯示，加味二陳湯可誘導(dǎo)人肺腺癌A549 細(xì)胞的凋亡，且呈濃度及時(shí)間依賴性，在中藥高劑量組更加明顯，且隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)誘導(dǎo)肺腺癌A549 細(xì)胞的凋亡的效果更加明顯。為進(jìn)一步探究其機(jī)制，筆者采用Western blot 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，加味二陳湯低劑量組和高劑量組ATF4、CHOP 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均增高，且呈劑量正相關(guān)關(guān)系。由此可見，加味二陳湯抑制肺癌移植瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡其機(jī)制可能與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白ATF4、CHOP 蛋白的上調(diào)機(jī)制從而完成其體外抗癌的作用有關(guān)。TUNEL 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組亦呈現(xiàn)一定程度的凋亡率，當(dāng)然這并不排除TUNEL 在檢測(cè)過程中，操作損傷細(xì)胞和壞死細(xì)胞當(dāng)作了凋亡細(xì)胞，此外腫瘤細(xì)胞自我更新快，生長(zhǎng)繁殖活躍，也存在一定數(shù)量的凋亡率。

5 結(jié)論

加味二陳湯可能通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白ATF4、CHOP 的表達(dá)而有效肺腺癌A549 移植瘤的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，且加味二陳湯抑制肺腺癌A549移植瘤的強(qiáng)度可能與中藥的藥物濃度呈正相關(guān)。