銀青抗感口服液指紋圖譜及解熱鎮痛抗炎藥效研究

王雅璐，張淑雅，汪晶，舒孌，王小莉，蘇克雷?

（1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫藥研究院，國家中醫藥管理局中藥口服制劑釋藥系統重點研究室，江蘇 南京 210028）

銀青抗感口服液是江蘇省中西醫結合醫院的醫療機構制劑，是江蘇省名老中醫朱啟勇主任醫師在銀翹散和桑菊飲的基礎上加減化裁而成，由金銀花、大青葉、板藍根、野菊花、荊芥、連翹、炙甘草等共10味藥組成；具有疏散風熱、清熱解毒等功效，主治伴有發熱、頭脹痛、咽喉紅腫疼痛、咳嗽、痰黏或黃、鼻塞黃涕等癥狀的感冒（風熱證）［1］。風熱感冒是風熱之邪犯表、肺氣失和所致，是感受風熱之邪所致的表證。“風熱感冒”一詞最早出現在《諸病源候論·風熱候》，載其：“風熱病者，風熱之氣，先從皮毛入于肺也。肺為五臟上蓋，候身之皮毛，若膚腠虛，則風熱之氣，先傷皮毛，乃入肺也。其狀使人惡風寒戰，目欲脫，涕唾出。”治療宜辛涼解表、發散風熱，常用銀翹散、桑菊飲等［2］。處方中的金銀花與連翹是治療新型冠狀病毒感染的“三方三藥”中連花清瘟顆粒、金花清感顆粒的共同藥材［3］。在新型冠狀病毒流行期間，銀青抗感方亦在臨床發揮了重要的作用，可以有效應對新型冠狀病毒引起的體溫升高、流涕、咽喉疼痛等癥狀。

中藥指紋圖譜能全面、定量地反映中藥所包含的化學信息，被廣泛應用于中藥和中藥制劑的質量控制研究工作［4-11］。銀青抗感口服液藥理作用及質量控制的研究較少，故本研究建立了銀青抗感口服液高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結合動物模型評價其解熱、鎮痛、抗炎的功效，為全面控制和評價銀青抗感口服液的質量奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，型號：Agilent 1260）；微量分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型號：XP-6）；離心機（上海安亭科技儀器廠，型號：TGL-16B）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司，型號：AG-22331）；細胞分析儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號：Attune NxT）；倒置光學顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司，型號：Ⅸ-73）；電子溫度計（德特寵物有限公司，型號：D-10）；酶標儀（Thermo，型號：Multiskan FC）；洗板機（HEALES，型號：PW-812）。

1.2 試劑及藥品

阿司匹林維生素C 泡騰片（拜耳醫藥保健有限公司，國藥準字J20140076）；干酵母（安琪酵母有限公司，國藥準字H51023524）；地塞米松（信宜有限公司，國藥準字H31020793）；二甲苯（南京化學試劑，批號：C0650110223）；乙酸（南京化學試劑，批號：A116166）；綠原酸（含量96.8%）、蒙花苷（含量 ≥ 98%）、連翹苷（含量98.9%）（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817、111528-202112、110821-200711）；新綠原酸（含量99.67%）、隱綠原酸（含量99.07%）、異綠原酸A（含量98.66%）、異綠原酸B（含量99.05%）、異綠原酸C（含量99.84%）、連翹酯苷A（含量98.33%）（成都曼思特生物技術有限公司，批號：MUST-20031002、MUST-20042403、MUST-21011110、MUST-20031602、MUST-20031603、MUST-21031105）；表告伊春（含量 ≥ 98%）（成都普菲德生物技術有限公司，批號：150715）；大鼠TNF-α、IL-1β 及IL-6 ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特有限公司，貨號：EL-R0012c、EL-R2856c、EL-R0015c）；銀青抗感口服液［江蘇省中西醫結合醫院中藥制劑室研制，批號：20210820（S1）、20210827（S2）、20210903（S3）、20210910（S4）、20210917（S5）、20210924（S6）、20210930（S7）、20211008（S8）、202101015（S9）、20211022（S10）］。

1.3 動物

SD 大鼠（SPF 級）62 只，江蘇中醫藥研究院動物中心提供，體質量180～200 g，雌雄各半，動物許可證號：SYXK（蘇）2021-0025，批號：202127438；KM 小鼠（SPF 級）48 只（江蘇中醫藥研究院動物中心），體質量（20±5）g，雌雄各半，動物許可證號：SYXK（蘇）2021-0025，批號：202120812、202120813。

2 方法

2.1 指紋圖譜的建立與評價

2.1.1 色譜條件

色譜柱采用SunfireTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相，進行梯度洗脫（0～22 min：10%A；22～27 min：10%～15%A；27～60 min：15%A；60～95 min：15%～20%A；95～120 min ：20%～32%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：327、245、202 nm；進樣量：10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液

分別精密稱定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹酯苷A、蒙花苷、連翹苷、表告伊春對照品于容量瓶中，加75%甲醇制備成質量濃度分別為58.210、170.720、61.400、67.290、69.480、73.480、46.140、23.350、87.560、58.360 μg/mL的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液

精密量取銀青抗感口服液5 mL，置250 mL容量瓶中，加超純水定容，混勻。取稀釋液5 mL，精密量取，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，混勻，離心，上清液經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 精密度考察

精密量取編號為S1 的銀青抗感口服液（批號：20210820）5 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄各共有峰的保留時間及峰面積［12］。以9 號峰異綠原酸B 為參照峰，計算可知各共有峰的相對保留時間的RSD均≤ 0.37%，相對峰面積的RSD 均 ≤ 3.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性考察

精密量取編號為S1 的銀青抗感口服液（批號：20210820）5 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄各共有峰的保留時間及峰面積［12］。以9號峰異綠原酸B為參照峰，計算可知各共有峰的相對保留時間的RSD 均 ≤ 0.37%，相對峰面積的RSD 均 ≤4.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.6 重復性考察

精密量取編號為S1 的銀青抗感口服液（批號：20210820）5 mL，平行6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各共有峰的保留時間及峰面積［12］。以9 號峰異綠原酸B為參照峰，計算可知各共有峰的相對保留時間的RSD均 ≤ 0.39%，相對峰面積的RSD 均 ≤ 2.48%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 特征指紋圖譜的生成與相似度評價

按“2.1.3”項下制備編號為S1～S10 的10 批銀青抗感口服液的供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣并記錄各樣品色譜圖，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012版）［13］。以S1為參照圖譜，時間窗寬度設置為0.3 min，生成銀青抗感口服液的對照特征指紋圖譜和10批銀青抗感口服液的HPLC特征圖譜匹配圖［12］，結果見圖1 和圖2。其中，共確認保留時間穩定的共有峰16個，以9號峰異綠原酸B為參照峰，指認出10個化合物結果，分別是1號峰（新綠原酸）、2號峰（綠原酸）、3 號峰（隱綠原酸）、8 號峰（連翹酯苷A）、9 號峰（異綠原酸B）、10 號峰（異綠原酸A）、11 號峰（異綠原酸C）、13 號峰（蒙花苷）、14 號峰（表告伊春）以及16 號峰（連翹苷），結果見圖3。

圖1 銀青抗感口服液的對照特征圖譜

圖2 10 批銀青抗感口服液樣品特征圖譜

圖3 銀青抗感口服液的對照特征指紋圖譜（R）及混合對照品的 HPLC 圖譜

以9 號峰異綠原酸B 為參照峰，計算S1～S10 號樣品的特征指紋圖譜與對照特征指紋圖譜的相似度，分別為0.912、0.926、0.950、0.948、0.940、0.950、0.953、0.956、0.946，均＞0.9，說明樣品穩定性、均一性較好。

2.2 銀青抗感口服液藥效學評價

2.2.1 給藥溶液的制備

不同濃度銀青抗感口服液的制備：取銀青抗感口服液（生藥量為1.373 g/mL）分別減壓濃縮至生藥量為2.162、2.343 g/mL備用。

陽性藥物的制備：取0.8 g阿司匹林維生素C 泡騰片用水分別配制成濃度為0.008 4 g/mL和0.014 1 g/mL的藥液備用；取0.75 mg 地塞米松用水配制成濃度為0.011 4 mg/mL的藥液備用。

2.2.2 實驗動物分組及給藥

解熱實驗：取SD 大鼠62 只，每天測量肛溫2 次（間隔60 min），連續3 d，選取溫度差小于0.3 ℃，且在36.6～38.8 ℃范圍內的大鼠進行實驗［14］。依據隨機數字表隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組和銀青抗感口服液高劑量、中、低劑量組（簡稱高、中、低劑量組）。除空白組外，其余各組大鼠背部皮下注射15%干酵母（10 mL/kg）致熱。陽性藥物組按阿司匹林10 mL/kg（濃度為0.008 4 g/mL），高劑量組按20 mL/kg（濃度為2.162 g/mL）、中劑量組按15 mL/kg（濃度為1.373 g/mL）、低劑量組按7.86 mL/kg（濃度為1.373 g/mL）分別灌胃藥液，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

抗炎實驗：取KM小鼠48只，依據隨機數字表隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組和銀青抗感口服液高、中、低劑量組（簡稱高、中、低劑量組）。陽性藥物組按地塞米松0.1 mL/10 g，高劑量組按0.27 mL/10 g（濃度為2.343 g/mL）、中劑量組按0.14 mL/10 g（濃度為2.162 g/mL）、低劑量按0.11 mL/10 g（濃度為1.373 g/mL）分別灌胃藥液，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續7 d。

鎮痛實驗：取KM小鼠48只，依據隨機數字表隨機分為空白組（等劑量生理鹽水）、模型組、陽性藥物組和銀青抗感口服液高、中、低劑量組（簡稱高、中、低劑量組）。陽性藥物組按0.1 mL/10 g（濃度為0.0141 g/mL），高、中、低劑量組按“2.2.3”項下劑量灌胃，每日1 次，連續7 d。

2.2.3 標本收集

解熱實驗中于初次給藥后0.5、1、2、3、4 h 分別測定大鼠體溫，腹主動脈取血并分離血清，保存于-80 ℃冰箱，備用。

抗炎實驗中第7 天給藥結束1 h 后，除空白組外，其他各組小鼠右耳正反面均勻涂抹40 μL 二甲苯溶液，誘導小鼠耳組織發炎腫脹，左耳不涂抹作為自體對照（對照組不處理）。0.5 h后眼眶取血，記錄血常規指標；頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用6 mm打孔器在兩只耳朵相同部位打耳片，稱重［15］。稱重后的耳組織一部分置于10%甲醛中固定，另一部分存入-80 ℃冰箱備用。

鎮痛實驗中第7天給藥結束1 h后，除空白組外，其他各組小鼠按0.1 mL/10 g腹腔注射0.6%醋酸溶液，引起小鼠疼痛［16-18］。觀察并記錄20 min內小鼠的扭體次數（以腹部內凹，軀干與后腿伸展，臀部高起為陽性反應）。

2.3 觀察指標

ELISA 試劑盒測定血清中的內源性致熱因子TNF-α 和IL-1β、IL-6 水平，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。取耳組織置于4%的甲醛固定，按常規步驟進行HE 染色，置光學顯微鏡下觀察耳組織病理形態的變化。記錄小鼠扭體次數，計算鎮痛抑制率。

鎮痛抑制率（%）=（模型組扭體次數-給藥組扭體次數）×100%

2.4 統計學方法

采用 SPSS 25.0 統計軟件分析實驗結果，數據以±s表示，采用單因素方差進行分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠造模后不同時間點體溫差比較

給藥1 h 后，各給藥組的體溫差與模型組相比均降低，表明藥物開始發揮療效。給藥2 h 后，各給藥組與模型組相比，P＜0.01。結果顯示，陽性藥物組療效最佳，高、中、低劑量組均具有降低體溫的作用，且體溫隨著劑量的增加而降低。結果見表1。

表1 各組大鼠造模后不同時間點體溫差比較（±s，℃）

表1 各組大鼠造模后不同時間點體溫差比較（±s，℃）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組4 h 0.08±0.09 1.01±0.17##0.24±0.28**0.33±0.17**0.41±0.10**0.49±0.07**n 10 10 10 10 10 10給藥劑量/（mL/kg）10 10 10 20 15.75 7.88 0 h 0.11±0.17 0.94±0.19##0.92±0.15##0.93±0.16##0.94±0.21##0.95±0.27##0.5 h 0.08±0.13 1.02±0.23##0.94±0.14 0.96±0.15 1.06±0.20 1.05±0.26 1 h 0.11±0.14 0.98±0.18##0.35±0.22**0.48±0.36**0.64±0.24**0.88±0.38 2 h 0.06±0.16 1.04±0.26##0.30±0.22**0.41±0.49**0.49±0.46**0.74±0.28**3 h 0.11±0.17 1.24±0.38##0.27±0.28**0.37±0.17**0.47±0.26**0.56±0.18**

3.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較

ELISA 結果顯示，與模型組相比，各給藥組中內源性致熱源TNF-α、IL-1β 及IL-6 的含量均有明顯的降低（P＜0.01），表明銀青抗感口服液的高、中、低劑量組均有解熱作用。同時這3 種因子也是重要的促炎因子，進一步說明銀青抗感口服液還具有一定的抗炎作用。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組IL-6 28.76±3.16 57.51±4.50##35.75±2.81**37.63±3.12**43.33±2.94**50.15±3.41**n8 8 8 8 8 8 TNF-α 43.43±4.43 96.76±4.71##54.12±3.91**52.47±3.95**69.71±4.84**83.11±6.46**IL-1β 92.06±5.56 144.01±5.47##103.80±7.21**100.90±5.63**117.85±5.65**129.12±5.99**

3.3 各組小鼠白細胞計數水平比較

抗炎實驗觀察到，與模型組相比，陽性藥物組和高劑量組均可明顯降低白細胞計數（P＜0.01）；中劑量組有降低白細胞計數的作用（P＜0.05）；低劑量組不明顯。結果見表3。

表3 各組小鼠白細胞計數水平比較（±s）

表3 各組小鼠白細胞計數水平比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

白細胞計數/（109/L）2.32±0.90 4.97±0.87##2.97±0.62**2.97±0.97**3.90±0.56*4.87±1.01組別空白組模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組n 6 6 6 6 6 6

3.4 HE染色結果

空白組小鼠耳組織較為狹窄，血管及周圍纖維組織細胞分層明顯；模型組小鼠耳組織明顯腫脹，血管及周圍纖維組織細胞分層模糊，出現明顯充血和水腫現象，橫紋肌纖維排列紊亂。不同劑量的銀青抗感合劑對耳組織腫脹程度有不同的改善。陽性藥物組與高劑量組僅存在部分水腫、充血和炎性細胞浸潤現象，低劑量組的充血和水腫現象仍十分明顯。結果見圖4。

圖4 各組小鼠耳組織HE染色結果圖（×200）

3.5 各組小鼠醋酸扭體實驗結果比較

與模型組比較，陽性藥物組和高劑量組有明顯鎮痛作用（P＜0.01）；中劑量組小鼠的扭體次數減少（P＜0.05）；低劑量組無明顯的鎮痛作用。結果見表4。

表4 各組小鼠醋酸扭體實驗結果比較（±s）

表4 各組小鼠醋酸扭體實驗結果比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組鎮痛抑制率/%—49.58 48.77 29.75 11.86 n8 8 8 8 8劑量/（mL/10 g）0.10 0.10 0.27 0.14 0.11扭體次數/次45.38±8.81 22.88±7.10**23.25±6.78**31.88±7.45*40.00±6.07

4 討論

感冒是一種急性感染性呼吸系統疾病，主要由流感病毒導致［19］。臨床用于治療感冒的抗病毒等藥物對患者的肝、腎功能具有一定的損害，而中醫藥防治該病具有安全性高、全面調節的優勢［20］。

感冒中最常見的是“風熱型”感冒，古籍《風熱候》中對感冒屬風熱癥的病因病機、表征和治愈過程都有較為詳細的描述［2］。認為風邪入侵是風熱感冒的主要病因，其病程與個人的正氣盛衰有關，易感程度與個人體質有關，氣虛皆易感，陰虛易感風熱［21］。

銀青抗感方處方量較大、化學成分復雜；前期預實驗中比較了不同比例的流動相系統，發現乙腈系統相較于甲醇系統出峰時間更短，磷酸水溶液相較于甲酸水溶液峰形更好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。采用DAD 檢測器全波長掃描，結果表明金銀花（君藥）、野菊花（臣藥）在327 nm 波長下分離度較好，板藍根（臣藥）在245 nm 下可以檢測出表告伊春含量，連翹（佐藥）在202 nm 波長下色譜峰豐富且分離度較好，故選用327、245、202 nm 這3 個檢測波長。最后對進樣前處理進行了考察，分別考察溶劑種類（甲醇、水）和除雜方式（離心、過膜），結果表明樣品濃度為50%的甲醇水溶液時異綠原酸A、B、C 的含量更高。 本研究通過HPLC 建立了銀青抗感口服液樣品的指紋圖譜，發現了16 個共有峰，并指認了其中的10 個共有峰，且結果表明10 批樣品的相似度均＞0.9，說明 10 批銀青抗感口服液樣品的相似度高，所建立的指紋圖譜能較全面地反映制劑中的整體質量。

通過建立3 種不同動物模型，給予不同劑量銀青抗感口服液以評估其藥效。在干酵母致熱實驗中，TNF-α是一種內源性致熱源，激活時可誘導巨噬細胞釋放IL-1β，IL-6 等因子，三者共同調節作用引起體溫升高，同時TNF-α、IL-1β、IL-6 也是典型的促炎因子，可引起炎癥反應［22］。筆者觀察到銀青抗感口服液可顯著降低模型大鼠的體溫，ELISA結果顯示銀青抗感口服液可顯著降低模型鼠血清中的TNF-α、IL-1β及IL-6等因子，表明銀青抗感口服液具有解熱及抗炎的功效。

白細胞數是血常規中的主要成分，具有抗感染、免疫調節等功能，包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等。當身體出現炎癥反應時，白細胞計數會出現病理性升高［16］。筆者發現銀青抗感口服液可改善模型鼠耳組織的水腫和充血，顯著降低模型鼠血清中白細胞指數，降低模型鼠的扭體次數，表明銀青抗感口服液具有抗炎及鎮痛的功效。

綜上所述，本研究中HPLC 方法結果準確、重復性好，可用于銀青抗感口服液方的質量評價。藥效學實驗證明銀青抗感口服液具有解熱、抗炎、鎮痛的功效，可為后續銀青抗感口服液治療風熱感冒的機制研究提供依據。