氮減量配施微生物菌劑對烤煙產量和土壤微生物多樣性的影響

武春屹，羅莎莎，楊 婷，盧穎林，和銳敏，鈕 越，張小莉，安玉興

（1.華南農業大學植物保護學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省科學院南繁種業研究所，廣東 廣州 510316）

【研究意義】煙草作為我國重要的經濟作物，在農業經濟中扮演著重要角色。目前烤煙產區常年過量使用化肥，特別是氮肥的不合理施用，是導致土壤板結、有機質含量下降以及微生物區系失衡的主要原因［1-3］。因此改善土壤質量，提高土壤生產力，進而改善煙葉品質，成為烤煙產區丞待解決的問題。【前人研究進展】減少氮肥的使用可降低硝態氮和銨態氮在土壤中的積累，減少土壤無機態氮的淋溶［4-5］。單獨減施氮肥容易導致作物產量下降、土壤有效養分降低、微生物多樣性減少等問題，而配施微生物菌劑可緩解因供氮不足引起的一系列問題［6-7］。微生物菌劑作為改良土壤的重要肥料之一，對改善土壤具有重要作用［8］。土壤微生物的變化以及物種之間的相互作用對植物健康起著重要作用，施用微生物菌劑是土壤生物改良的典型措施，可通過調控土壤生態環境，從而改善土壤質量［9-10］。微生物菌劑中的有益微生物可通過產生植物激素類、維生素類和核酸類等物質來改善土壤結構，提高植物溶磷、固氮、解鉀能力，從而達到改善土壤環境、提高作物品質、減少對化肥的依賴性的目的［11-13］。研究表明，微生物菌肥對促進煙株生長、改善土壤理化性質、提高煙葉品質、提高土壤微生物多樣性等方面有顯著作用［14-17］。李茜等［18］研究發現，施用微生物菌肥可顯著提升烤煙農藝性狀、降低煙株發病率及發病指數，提高烤后煙葉香氣物質含量。化黨領等［19］研究發現，施用生物有機肥可顯著提高煙葉各處理類胡蘿卜素、類西柏烷類、苯丙氨酸類，新植二烯類和其他類別香氣物質含量。傅獻忠等［20］研究表明，施1 200 kg/hm2的烤煙專用復合微生物肥有利于中部煙葉香氣量增加，減少雜氣和刺激性；施1 800 kg/hm2時上部煙葉有雜氣和刺激性減輕、余味變舒適的趨勢。李怡博等［21］研究發現，微生物菌劑配施高碳基肥料可顯著提高土壤微生物多樣性，并且增加土壤中堿解氮、速效磷、速效鉀和有機質含量。張良［22］通過大田試驗發現，微生物菌劑配合有機無機肥施用可使烤煙化學成分更加協調，提高了烤煙總糖、還原糖和鉀含量。毛云等［23］研究發現，常規施肥配合施加微生物菌肥上等煙比例、上中等煙比例產量、產值和均價分別提高4.4%、3.8%、5.8%、11.51%和5.73%。姜永雷等［24］研究發現，隨著連作年限的增加，施加微生物菌劑的土壤和未施加微生物菌劑相比，有機碳、全氮、有效磷含量呈上升趨勢。【本研究切入點】目前，常規施肥條件下配施微生物菌劑對烤煙產量和煙田土壤改良的研究較為多見，但在減氮條件下配施微生物菌劑卻少有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過探討微生物菌劑配合減氮施肥對烤煙產量及土壤微生物多樣性的影響，以期進一步探討微生物菌劑替代部分氮肥的可行性，為實現煙田化肥減施增效提供理論依據及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022 年2—6 月于梅州市五華縣岐嶺鎮（24°06′ N，115°49′ E）進行，該區屬亞熱帶季風氣候，2022 年年均氣溫21.8 ℃，年降雨量1 617 mm，年總日照時數2 215.1 h。試驗地耕作方式為水稻-煙草連作。

供試烤煙為當地主栽品種為云煙87。微生物菌劑為廣東省科學院南繁種業研究所自主分離發酵的甲基桿菌（Methylobacterium populi）菌劑，保藏編號為GDMCC No：61052，該菌劑已被證明有較好的促生長和固氮效果，且已在辣椒苗上應用有較好的促生作用［25］。

1.2 試驗方法

試驗采用隨機區組設計，設T1 當地常規施肥（CK）、T2 常規施肥＋微生物菌劑、T3 常規施肥減氮10%＋微生物菌劑、T4 常規施肥減氮20%＋微生物菌劑4 個處理，每個處理3 次重復，小區面積30 m2，煙草種植行距為1.1 m。施肥量參考當地常規施肥標準，T1、T2 處理每667m2N、P2O5、K2O 用量分別為9.0、4.5、22.5 kg，T3 處理每667m2N、P2O5、K2O 用量分別為8.1、4.5、22.5 kg，T4 處理每667m2N、P2O5、K2O 用量分別為7.2、4.5、22.5 kg。微生物菌劑施用標準：將250 mL 菌液與水混合均勻，作為定根水施用，然后至打頂前每隔30 d 施用1 次，共施用4 次。微生物菌劑施用方法：煙草移栽時將微生物菌劑與定根水一起施入，移栽后至采收期每隔30 d 灌根1 次，每667m2施用量為每次5 L。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 烤煙農藝性狀 按照國家標準YC/T142-2010［26］，選取小區長勢均勻的10 株煙株進行掛牌標記，分別于團棵期、旺長期和成熟期測量株高、莖圍、葉片數，上、中、下部位的葉長、寬。

1.3.2 烤后煙葉經濟性狀 各小區調制后煙葉分別掛牌標記、分級扎把，計算產量，按當地收購價格計算各處理經濟性狀。

1.3.3 土壤微生物多樣性 于2022 年6 月煙草成熟期將0～30 cm 耕層煙草根系挖出，每小區3 株，抖落根系外圍土，用消毒的軟毛刷刷下根系表層的根際土壤，混合均勻后放入無菌封口袋，于-80 ℃保存，用于DNA 提取。

土壤微生物多樣性測序采用第二代高通量測序技術，對煙株成熟期采集的土壤樣本進行細菌16S rDNA 和真菌ITS DNA 序列檢測，DNA 抽提和PCR 擴增、Illumina Miseq 測序和數據處理，參考陳乾錦等［27］的方法。

2 結果與分析

2.1 減量施氮配施微生物菌劑對烤煙農藝性狀的影響

由表1 可知，不同處理對烤煙株高、莖圍、葉片數無顯著差異，總體來看，團棵期株高以T4處理最高（19.33 cm），莖圍以T1 處理最大（5.00 cm）；旺長期株高以T2 處理最高（93.00 cm），莖圍以T4 處理最大（8.33 cm）；成熟期株高以T4 處理最高（98.66 cm），莖圍以T3 處理最大（8.66 cm）；團棵期葉片數的變化范圍為11～13 片，旺長期為16～19 片，成熟期為13～16 片，表明一定范圍內減氮配施微生物菌劑可穩定烤煙生長。

表1 不同處理對烤煙主要農藝性狀的影響Table 1 Effects of different treatments on major agronomical traits of flue-cured tobacco

2.2 減量施氮配施微生物菌劑對烤煙經濟性狀的影響

由表2 可知，與T1 處理相比，其他處理烤后煙葉中上等煙比例無顯著差異，上部上等煙比例以T1 處理最高（13.88%），中部上等煙比例以T2 處理最高（33.68%）；上部中等煙比例以T4 處理最高（33.65%），中部中等煙比例以T3處理最高（22.8%），下部中等煙比例以T3 處理最高（15.49%）；下等煙比例以T1 處理最高（13.88%），表明配施微生物菌劑可減少下等煙比例，增加中部上等煙和中等煙的比例。不同處理產量和產值表現為T2 ＞T3 ＞T1 ＞T4，其中T4 處理每667m2產值為1 351.56 元，低于其他處理，且較T2 處理差異顯著；T3 處理產量和產值較T1 處理分別提高18.2%和12.5%，表明一定程度減氮配施微生物菌劑提高了烤煙產量和產值。

表2 不同處理對烤煙主要經濟性狀的影響Table 2 Effects of different treatments on major economic traits of flue-cured tobacco

2.3 減量施氮配施微生物菌劑對煙田土壤理化性質的影響

由表3 可知，相比T1 處理，其他處理土壤理化性質差異不顯著，土壤不同理化指標如下：土壤pH（5.42～5.45 g/kg），有機質（43.09～45.72 g/kg），有機碳（25.00～26.52 g/kg），水溶性有機 碳（124.09～144.12 g/kg），全 氮（2.29～2.59 g/kg），全磷（1.30～1.53 g/kg），全鉀（9.73～10.55 g/kg），堿解氮（232.51～240.12 mg/kg），有效磷（59.26～78.40 mg/kg），速效鉀（460.20～576.72 mg/kg）；相比T1 處理，T3 處理全氮、速效鉀含量有所增加，T4 處理全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷和速效鉀均有所減少但未達到顯著水平，表明減氮配施微生物菌劑對土壤有效養分含量無顯著影響。

表3 不同處理對煙田土壤理化性質的影響Table 3 Effects of different treatments on physicochemical properties of tobacco field soil

2.4 減量施氮配施微生物菌劑對根際土壤細菌和真菌群落多樣性的影響

2.4.1 微生物群落α多樣性 由Venn 圖可知，煙田根際土壤細菌總OTUs 數共有7 857 個，T1、T2、T3、T4 處理分別為2 496、3 144、2 497、2 565 個，T2 較T1增加25.96%，T3、T4 與T1 無顯著差異；T1、T2、T3、T4處理獨有的OTUs 數分別為1 228、2 068、1 391、1 399 個，T2 較T1 增加68.4%（圖1A）。真菌總OTUs 數量為2 554 個，T1、T2、T3、T4 處理分別為710、1 138、1 100、828 個，T2、T3、T4處理T1 分別增加60.2%、54.9%和16.6%，以T2 數量最多；T1、T2、T3、T4 處理獨有的OUTs 數量分別為312、578、556、400 個，T2、T3 分別較T1增加85.2%和78.2%，其中T2 獨有的OTUs 數量占比最大，表明施用微生物菌劑可以提高根際土壤細菌和真菌OUTs 群落總數和獨有的OUTs 數量（圖1B）。由圖2、圖3 可知，微生物菌劑T2、T3 處理顯著提高了煙田根際土壤真菌的豐富度（Chao 指數），細菌豐富度無顯著差異，真菌和細菌多樣性無顯著差異（Shannon 指數）。

圖1 不同處理下根際土壤中細菌（A）和真菌（B）群落維恩圖Fig. 1 Venn diagram of bacterial (A) and fungal (B) communities in rhizosphere soil under different treatments

圖2 不同處理下根際土壤中細菌群落α 多樣性指數Fig. 2 α diversity indexes for bacterial communities in rhizosphere soil under different treatments

圖3 不同處理下根際土壤中真菌群落α 多樣性指數Fig. 3 α diversity indexes for fungal communities in rhizosphere soil under different treatments

2.4.2 微生物群落β 多樣性 屬分類水平下對煙田根際土壤細菌群落結構組成的相似性分析表明，不同細菌群落結構差異顯著（R=0.547，P=0.001）；基于Weighted Unifrac 距離的NMDS分析也表明，各土壤細菌群落明顯分為4 類，不同處理對細菌群落結構分布影響顯著（圖4A）。屬分類水平下的相似性分析表明，不同處理真菌群落結構為T1、T4 處理與T2、T3 處理差異顯著（R=0.63，P=0.002）；NMDS 分析也表明，T1、T4 處理距離T2、T3 處理較遠，即真菌物種組成有一定差異，T2 與T3 處理距離接近，表明T2 與T3 處理根際土壤的真菌組成較為相似，T1 和T4處理組成成分較為相似（圖4B）。

圖4 不同處理下根際土壤中細菌（A）和真菌（B）群落多樣性的NMDS 分析Fig. 4 NMDS analysis of the bacterial (A) and fungal (B) communities diversity in rhizosphere soil under different treatments

2.4.3 微生物群落結構 由圖5A、表4 可知，本試驗條件下細菌物種相對豐度以變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、放線菌門（Actinobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）為主要菌門，其相對豐度分別占各處理總細菌豐度的78.3%（T1）、76.5%（T2）、82.5%（T3）、80.2%（T4），其中T4 處理變形菌門豐度高于其他處理，T4 和T1處理酸桿菌門豐度高于T2 和T3 處理。

圖5 不同處理下根際土壤中細菌（A）和真菌（B）群落的相對豐度（門水平）Fig. 5 Relative abundance of bacterial (A) and fungal (B) communities in rhizosphere soil under different treatments (phylum level)

表4 不同處理對根際土壤中細菌門水平相對豐度的影響Table 4 Effects of different treatments on relative abundance of the bacterial communities in the rhizosphere soil at phylum level

由圖5B、表5 可知，真菌優勢菌門以子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）為主要菌門，其相對豐度分別占各處理總真菌豐度的90%（T1）、91%（T2）、91.5%（T3）、80%（T4）。真菌門水平各處理無顯著差異。

表5 不同處理對根際土壤中真菌門水平相對豐度的影響Table 5 Effects of different treatments on relative abundance of the fungal communities in the rhizosphere soil at phylum level

由圖6 可知，細菌屬水平上物種相對豐度分別以未分類細菌（Unclassified-Bacteria）、芽單胞菌屬（Gemmatimonadaceae）、硫 磺菌屬（Vicinamibacteraies）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）為主要菌屬，占總豐度的25%～30%。由圖7 可知，真菌屬水平上物種相對豐度分別以鐮刀菌屬（Fusarium）、油壺菌屬（Olpidium）、毛殼屬（Chatetomium）為主要菌屬，占總豐度17%～30%。

圖6 不同處理下根際土壤中細菌群落的相對豐度（屬水平）Fig. 6 Relative abundance of bacterial communities in rhizosphere soil under different treatments (genus level)

圖7 不同處理下根際土壤中真菌群落的相對豐度（屬水平）Fig. 7 Relative abundance of fungal communities in rhizosphere soil under different treatments (genus level)

利用LefSe 分析研究不同處理間具有統計學差異的物種，由圖8 可知，T1 處理細菌的標志性物種為未分類的酸桿菌門（p _Acidobacteriales）、全噬菌綱（c_Holophagae）、多囊菌目（o_Polyangiales）、中華單胞菌屬（g_Sinomonas）、Pajaroellobacter屬，T2 處理的標志性物種為綠彎菌科（f_Unclassified _Chloroflexi）、厭氧繩菌屬（g_Unclassified_Anaerolineaceae）、硫磺球菌科（f_Vicinamibacteraceae）、未分類的芽單胞菌種（s_Unclassified_Gemmatimonadaceae），T3 處理的標志性物種為綠彎菌門（p_Chloroflexi）、纖線桿菌目（o_Ktedonobacteriales），T4 處理的標志性物種為α-變形菌綱（c_Alphaproteobacteria）、鞘氨醇單胞菌目（o_Sphingomonadales）、芽單胞菌屬（g_Gemmatimonas）、擬桿菌綱（c_Bacteroidota）、叢毛單胞菌科（f_Comamonadaceae）、黃單胞菌科（f_Xanthomonadaceae）、黃桿菌目（o_Flavobacteriales）、草酸桿菌科（f_Oxalobacteraceae）、馬賽菌屬（g_Massilia）、慢生根瘤菌屬（g_Bradyrhizobium）、擬單胞菌 目（o_Pyrinomonadales）、固氮螺菌屬（g_Arenimonas）。由圖9 可知，T1 處理真菌的標志性物種以隔孢假殼科菌種（s_Phaeosphaeria_thysanolaenicola）、鐮刀菌種（s_Fusarium_equiseti）為主，T2 處理標志性物種以未分類叢赤殼屬（g_unclassified_Nectriaceae）、羅茲菌門（p_Rozellomycota）、未分類毛殼菌種（s_Unclassified_Chaetomiaceae）為主，T3 處理標志性物種為糞殼菌綱（c_ Sordariomycetes）、毛殼菌科（f_Chaetomium），T4 處理標志性物種以阿太菌屬（g_Athelia）和曲霉屬（g_Aspergillus）為主。

圖8 不同處理下細菌差異物種的分支Fig. 8 Branch of bacterial differential species under different treatments

圖9 不同處理下真菌差異物種的分支Fig. 9 Branch of fungal differential species under different treatments

3 討論

土壤供氮不足是引起烤煙種植產量和品質下降的主要原因之一［28-29］。微生物菌劑配合減氮施肥與常規施肥相比產量未降低，可能是由于微生物菌劑中的活菌代謝活動直接影響了烤煙生長過程中的碳氮代謝，從而間接影響烤煙的呼吸作用和光合作用以及同化物分配規律等［30-32］，促進了烤煙成熟期的充分成熟。

土壤微生物在土壤養分轉化和循環、有機質的分解等方面起著重要作用，是土壤肥力關鍵指標之一［33］。研究表明，高劑量的氮肥施用是造成土壤質量惡化的主要原因之一，而低劑量的氮肥施用容易造成土壤養分降低，進而導致微生物多樣性下降［34］，微生物菌劑的施用可緩解因供氮不足引起的微生物多樣性降低［35］。本研究中，T2、T3 處理與T1 處理相比，煙田根際土壤真菌OTUs 數量和真菌豐富度（Chao 指數）顯著提高，這與Yang 等［36］研究結果一致，原因可能是微生物菌劑的施用促進土壤真菌繁殖，增加了適宜真菌的生存空間和營養競爭。微生物菌劑含有的有益微生物能夠刺激土壤中微生物數量的增加，較高的微生物數量和豐富度有利于土壤中氮磷鉀等營養元素的吸收利用［37-38］，從而間接影響烤煙的產量和質量。

微生物菌肥的施用不僅能提供比化肥更豐富的養分，還可以將自帶的有益微生物引入土壤，激活土壤中有益微生物的活性［39-41］。本研究高通量測序結果表明，不同施肥處理細菌組成主要為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門，其次為綠彎菌門、芽單胞菌門等，其中T4 處理較其他處理顯著提高了變形菌門的相對豐度，這與蘇夢迪［42］、桑文等［43］的研究結果一致，變形菌門能利用土壤中的復雜有機物和植物秸稈作為碳源和氮源。本試驗中，T4 處理的變形菌門顯著高于其他處理，可能是外源氮素的不足促進了變形菌門的生長以有效降解吸收土壤中的難溶性養分，從而維持烤煙的正常生長，變形菌門對土壤難溶性養分的降解可能是減氮后土壤養分與常規施氮處理無顯著差異的原因之一。變形菌門是一種革蘭氏陰性菌，能夠在不同的土壤環境中占據主導地位，變形菌門中包含著大量改善土壤環境的有益微生物，它的許多類群與根瘤菌的共生固氮有關［44］。配施微生物菌劑影響了優勢菌種的組成，從而使土壤微生物環境更穩定。因此，配施微生物菌劑可能是導致土壤中變形菌門提高的主要原因，具體原因有待進一步探究和驗證。不同處理真菌組成主要為子囊菌門、擔子菌門和壺菌門，各處理間無顯著差異。環境因素可能會影響較低分類單元的微生物群落結構組成，而對門分類水平則影響較小［45］。

通過配合施用微生物菌劑并未顯著提高土壤微生物群落多樣性，這與Poulsen 等［46］研究結果一致，主要原因為群落結構的改變，增加/減少的類群可以被其他減少/增加的類群補償。通過LefSe 分析表明，不同處理之間微生物群落組成變化明顯。本試驗發現，T4 處理的標志性物種為α-變形菌綱、鞘氨醇單胞菌目、芽單胞菌屬、擬桿菌綱、慢生根瘤菌屬、固氮根瘤菌屬等。前人研究發現，這些細菌都是促進植物生長的有益菌［47-48］，猜測原因為外源微生物菌劑刺激了土壤中有益菌的生長，具體原因有待進一步驗證。變形菌中包含大量農田生態系統中的有益微生物，α-變形菌綱屬于變形菌門的一個綱，是陸地土壤中的優勢菌，其中的根瘤菌具有固氮功能［49-50］。鞘氨醇單胞菌和芽單胞菌屬于根際促生菌，能夠在作物生長過程中減少病害的發生并促進根系的生長，同時促進動植物殘體的分解和養分的釋放［51-53］。擬桿菌與土壤大團聚體含量密切相關［54］。慢生根瘤菌屬、固氮根瘤菌屬等是禾本科植物主要的固氮菌，能夠為植物提供其生長所需的大量氮素［55］。減氮配施微生物菌劑能夠為土壤中有益微生物提供適宜的生長環境，促進有益微生物的富集。土壤中有益微生物的增加能夠促進煙株生長發育、提高煙葉品質和植物抗逆性。T1 處理真菌差異性物種表現為鐮刀菌種的數量高于其他處理，可能原因為其他處理由于微生物菌劑的施用導致有益微生物對潛在病原的拮抗，鐮刀菌是一種引起煙草枯萎病和根腐病危害極大的真菌病害［56-57］。微生物菌劑中的有益菌可通過產生抑菌活性物質抑制病原菌的生長，保護植物免受病原菌的侵染［58］。Shen 等［59］研究發現施用微生物菌肥可顯著降低鐮刀菌的豐度，減少枯萎病的發生。本研究通過分析烤煙農藝性狀、經濟性狀、土壤理化性質和微生物群落結構，初步明確了減氮配施微生物菌劑施肥技術在穩產和土壤改良中的可行性，本試驗后期會結合長期定位試驗進一步探討其機理研究。

4 結論

本研究結果表明，減氮施肥配施微生物菌劑穩定了烤后煙葉總產量，常規施肥配施微生物菌劑和減氮10%配施微生物菌劑烤煙產值較常規施肥分別增加12.8%和12.5%。微生物菌劑處理顯著提高了煙田根際土壤細菌和真菌OTUs 數量以及其獨有的OTUs 數量，常規施肥配施菌劑和減氮10%配施菌劑顯著提高了真菌豐富度。減氮20%配施微生物菌劑顯著提高了土壤中優勢菌變形菌門的相對豐度，并且顯著增加了土壤中α-變形菌綱和鞘氨醇單胞菌目等有益菌的相對豐度，改善了土壤細菌群落結構。綜上所述，減氮10%配施微生物菌劑效果最好，在穩產的同時烤煙產值較常規施肥提高12.5%，且增加了煙草根際土壤中有益細菌的相對豐度和真菌OTUs 數量及真菌豐富度。