烤煙全生育期覆膜栽培對植煙土壤理化性質及細菌群落結構的影響

郭 沖，曾淑華，劉雅潔，楊懿德，楊 洋，鄢 敏，陳佛源，韓 偉，劉 雷

（1.四川農業大學農學院，四川 成都 611130；2.四川省煙草公司宜賓市公司，四川 宜賓 644600）

【研究意義】土壤微生物在養分循環、有機質分解、土壤肥力維持和改善、土傳病蟲害防治等方面發揮著重要作用［1-3］。【前人研究進展】前人研究表明，植煙土壤微生物群落結構與土壤理化性質和養分含量密切相關［4-5］，這可能是導致青枯?。?-8］等一系列田間病害的原因。隨著分子生物學技術的發展，宏基因組學已成為研究微生物種群動態的有力工具。高通量測序技術打破了傳統培養方法的局限性，可以全面分析微生物總DNA，靈敏、快速的檢測環境樣品中微生物群落結構及其多樣性［9-11］。王亞月等［12］通過高通量Illumina MiseqTM 宏基因組16S rDNA 測序，研究了4 種生防菌對煙草黑脛病的防治效果及對根際土壤微生物群落結構的影響。張藝潔等［13］利用宏基因組16S rDNA 測序技術獲得了煙草根際土壤中豐富的細菌信息，結果表明細菌多樣性水平較高，不同樣品間主要細菌群落結構分布相對穩定。以上研究表明基于宏基因組學研究土壤微生物群落結構的技術日趨成熟。

覆膜栽培是一項在全球范圍內應用廣泛的農業技術，具有直接的經濟和環境效益，如提高作物產量和改善品質、提高水分利用率、改善土壤質量、減少溫室氣體排放和硝酸鹽流失等功效［14］。對土壤微生物的影響方面，有研究表明烤煙覆膜栽培有利于土壤微生物的積累，可顯著增加土壤微生物的數量［15］。另有研究指出，地膜覆蓋可輕微增加叢枝菌根真菌（AMF）和細菌的多樣性［16］，但對氨氧化細菌的多樣性沒有影響［17］。一項為期28 年的研究表明，地膜覆蓋增加了變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度［18］。然而，Luo 等［19］通過對土壤微生物群落的磷脂脂肪酸（PLFA）分析發現，覆膜處理使PLFAs 總量顯著降低了21.5%，真菌、細菌和放線菌的絕對豐度分別降低了26.7%、23.1%和24.6%。綜上，覆膜栽培對煙草土壤微生物數量和群落結構的影響仍存在一定爭議?！颈狙芯壳腥朦c】烤煙栽培通常需要適時揭膜，但在一些較高海拔的冷涼煙區，全生育期覆膜栽培技術也有一定推廣。孔德鈞等［20］、楊春江等［21］的研究表明，在高海拔（1 800 m）、多雨煙區進行全生育期覆膜栽培可增加烤煙的產值量。目前，關于全生育期覆膜栽培技術的相關研究較少，對這種栽培模式下土壤理化性質和微生物群落結構變化的研究也幾乎缺失。【擬解決的關鍵問題】為進一步解決高海拔冷涼煙區烤煙生長中后期溫度不足、暴雨沖刷導致的嚴重水土流失等問題，本研究通過全生育期覆膜栽培的方式有效避免了以上問題，并明確其對植煙土壤理化性質及細菌群落結構的影響，可為烤煙覆膜栽培技術的完善成熟提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗設計

試驗于2020 年4—9 月在宜賓市興文縣仙峰苗族鄉群魚社區（28°23′67″N、105°05′94″E，海拔1 153.6 m）開展。供試煙草品種為云煙87，煙苗于2020 年4 月16 日移栽，9 月10 日采收完畢。設置1 個對照（CK）：白色地膜覆蓋，并于移栽后50 d 揭膜；3 個處理（整個生育期均不進行揭膜）：（1）白色地膜覆蓋（BY）；（2）黑色地膜覆蓋（HY）；（3）黑白雙色地膜（中間1/3 白色，兩邊各1/3 黑色）覆蓋（SY）。采用隨機區組設計，設置3 次重復，小區面積為66.7 m2，植煙110 株，行株距為1.1 m×0.55 m。根據當地優質煙葉生產技術，以煙草專用復合肥（600 kg/hm2）和過磷酸鈣（200 kg/hm2）作為基肥施入；在移植30 d 后，以90 kg/hm2的硝酸鉀（m［N］∶m［K2O］=1∶3.3）作第一次追肥施入；在移栽50 d 后，以200 kg/hm2的硫酸鉀作第二次追肥施入。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙葉和土壤取樣及測定 按照GB 2635－1992 對初烤煙葉進行分級，并記錄上、中、下等級煙葉質量，按照當地收購價計算均價和產值［22］。在揭膜后每隔5 d 使用地溫計（創紀美CJM-367）進行一次測溫，測溫時間為每天的8：00、14：00、20：00，并以公式T=（2T14+T8+T20）/4計算當天的平均溫度。土壤含水率的測定使用烘干稱重法進行，在揭膜后10、20、30、40、50 d用土鉆分別收集0～10、10～20 和20～30 cm 的土層土樣，運回實驗室烘干、稱重和測量，平均含水量的計算公式為W=（W10+W20+W30）/3。在烤煙成熟采收結束時，使用五點取樣法（每點3株）從每個小區15 株煙根部收集土壤樣本。首先去除土壤表層0～5 cm 土樣，將煙株連根挖起并輕搖根系周圍的土壤，然后將附著在根部表面的土壤作為根際土壤進行取樣。田間收集的土樣立即密封到制冷管中，并放入液氮罐中保存。冷凍的土樣被運送到實驗室后，立即通過2 mm 土篩過篩，以清除碎片和石頭。其中，一些土樣用于16S rDNA 測序分析，一些土樣置于室內風干（48 h）、碾磨，并用于土壤理化性質分析，其余土樣放入液氮罐中備存，直到確定土壤理化性質和細菌群落結構。土壤pH 值、有機質、全氮、全磷、全鉀和堿解氮、有效磷、速效鉀等含量的測定參照文獻［23-24］。

1.2.2 細菌16S rDNA 測序 使用土壤DNA 快速自旋試劑盒（MP Biomedicals，anta Ana，CA，USA）和FastPrep FP120 細胞干擾器（Qbiogene，Canada）從0.5 g 新鮮土樣中提取微生物總DNA。將提取的DNA 溶解在50 μL 的TE 緩沖液中，并立即在-20 ℃環境中冷凍，再進一步分析。使用引物319 F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806 R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3），以12 個樣本的總DNA 為模板對細菌16S rRNA的V3-V4 區域進行擴增。PCR 在熱梯度循環器（Eppendorf，Hamburg，Germany）中進行，98 ℃初始變性30 s，隨后繼續在此溫度下進行35 個周期循環，每周期持續10 s，52 ℃條件下退火30 s，72 ℃延伸45 s，并在此溫度下最終延伸10 min，通過2%的瓊脂糖凝膠電泳確認PCR 產物。

1.3 數據統計與分析

利用 Excel、Canoco（4.5）軟件、R 語言統計軟件和SPSS（24.0）數據處理系統對數據進行統計分析，并利用Duncan’s新復極差法和皮爾遜積差相關進行數據的多重比較和相關性分析。分類操作單元（OTU）被定義為一組具有相同限制條件的序列，采用QIIME［25］方法估算細菌多樣性指數：

式中，Sobs和N分別表示庫中OTU 的總數和克隆的數量，pi=ni/N。根據Chao［26］描述的方法確定稀有度、非參數豐度指數和偏差校正的物種豐度估計值。

采用線性判別分析（LDA）效應量法（LEfSe）對各處理間豐度有顯著差異的細菌類群進行鑒定。在LEfSe 分析中使用Kruskal-Wallis（KW）和秩檢驗（α=0.05）檢測特定類群之間顯著不同的特征豐度，然后使用線性判別分析來估算每個差異豐度的效應大?。↙DA＞2.0）。此外，為防止冗余數據的干擾，本研究對分類級別從定義域到屬進行了限制。

2 結果與分析

2.1 全生育期覆膜對烤煙經濟性狀的影響

由表1 可知，全生育期不同顏色地膜覆蓋處理的產量和產值均顯著優于對照（CK），在均價和中上等煙比例上，雙色地膜覆蓋（SY）處理明顯優于對照和其他處理。產量上，雙色、黑色、白色地膜覆蓋處理分別較對照增產13.33%、18.24%、21.36%；產值上，雙色、黑色、白色地膜覆蓋處理分別較對照增值20.26%、15.87%、13.28%。綜上，和揭膜處理相比，全生育期覆膜處理可顯著提高烤煙的產值量，地膜顏色以黑白雙色膜最優。

表1 不同覆膜處理對烤煙經濟性狀的影響Table 1 Effects of different film mulching treatments on economic characters of flue-cured tobacco

2.2 全生育期覆膜對植煙土壤理化性質的影響

成熟期，不同覆膜處理植煙土壤理化性質分析表明，各項土壤理化性質指標在不同處理和對照間均存在顯著差異，全生育期地膜覆蓋顯著提高了土壤溫度、全鉀和全磷含量，分別較對照提高1.62%～4.11%、0.70%～5.58%和3.11%～27.33%，降低了土壤pH 和堿解氮含量，分別降低3.02%～4.80%和10.45%～14.50%。此外，白色地膜覆蓋處理（BY）的土壤有機質、總氮、有效磷、速效鉀等指標均顯著低于CK 和其他處理，土壤含水量則表現相反（表2）。

表2 不同覆膜處理下植煙土壤基本理化性質差異Table 2 Basic physicochemical properties of tobacco-planting soil under different film mulching treatments

為進一步闡明全生育期地膜覆蓋對植煙土壤的影響，我們還分析了不同覆膜處理土壤中、微量元素含量的差異。結果表明，與CK 相比，各覆膜處理土壤的全鐵和有效銅含量顯著增加，增幅分別為1.73%～4.81%和4.76%～19.05%，有效鐵、全銅和全鋅含量則顯著降低，降幅分別為3.36%～13.43%、2.25%～9.32%和7.69%～10.01%。此外，雙色地膜覆蓋（SY）處理的有效鋅含量最高，黑色地膜覆蓋（HY）處理的有效鈣和有效硫含量最高，白色地膜覆蓋（BY）處理的有效鎂、有效氯和有效硼含量顯著高于CK 及其他處理（表3）。

表3 不同覆膜處理下植煙土壤中、微量元素含量差異Table 3 Content differences of trace elements in tobacco-planting soil under different film mulching treatments

2.3 全生育期覆膜對植煙土壤α 多樣性的影響

α 多樣性是指一個特定環境或生態系統的多樣性，主要通過Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson 等指數來反映物種豐富度和均勻度以及測序深度。Chao 1、Observed_species 指數主要反映樣本的物種豐富度信息；Goods_coverage 指數反映樣本的低豐度特征值覆蓋情況；Simpson、Shannon 指數主要體現物種的豐富度和均勻度。各覆膜處理和CK 在Shannon或Simpson 指數上差異不顯著。CK 的OTU 數及Chao 1 指數顯著高于其他處理，其中CK 的Chao 1 指數分別比白色（BY）、雙色（SY）、黑色地膜覆蓋（HY）處理高14.09%、24.20%、24.81%，表明地膜覆蓋可不同程度地抑制植煙土壤中細菌的豐富度，但對均勻性無明顯影響。各覆膜處理和CK 的覆蓋度指數均大于99%，可準確反映樣本的真實情況。HY 處理的覆蓋度指數顯著高于CK，但與BY 和SY 處理無明顯差異，表明HY 處理較CK 能顯著提高物種低豐度覆蓋度指數（表4）。

表4 不同覆膜處理對植煙土壤α 多樣性的影響Table 4 Effects of different film mulching treatments on α diversity in tobacco-planting soil

2.4 全生育期覆膜對植煙土壤細菌群落結構的影響

根據Illumina 平臺的測序結果，本研究選擇了相對豐度最高的10 個菌門進行分析。結果表明，變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）6 種菌門的相對豐度在對照和各地膜覆蓋處理中均較高，且占總的OTUs 80%以上（圖1）。

圖1 不同覆膜處理下根際細菌門水平相對豐度Fig. 1 Relative abundance of rhizosphere bacteria in different film mulching treatments at the phylum level

熱圖反映了各土壤樣本中優勢菌屬的相對豐度，我們將各分類水平相對豐度最高的30 個群落組成數據依照分類單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類，根據聚類結果對分類單元和樣本分別進行排序，并通過熱圖（圖2）加以呈現。由圖2 可知，CK 的優勢菌屬為Haliangium、嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和MND1；白色地膜覆蓋（BY）處理的優勢菌屬為全噬菌屬（Holophaga）、分枝菌屬（Ramlibacter）、Ellin6067和慢生根瘤菌屬（Bradyrizobium）；雙色地膜覆蓋（SY）處理的優勢菌屬為硝化螺菌屬（Nitrospira）、Bryobacter、羅河干菌屬（Rhodanobacter）、Candidatus_Solibacter、RB41、Candidatus_Udaeobacter和Reyranella；黑色地膜覆蓋（HY）處理的優勢菌屬為芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、MND1、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）和Chujaibacter。

圖2 不同覆膜處理根際細菌群落屬水平的層次聚類熱圖Fig. 2 Hierarchically clustered heatmap of rhizosphere bacterial communities under different film mulching treatments at the genus level

通過LEfSe 分析明確了3 個處理組（BY、HY、SY）和對照組（CK）的差異類群。在細菌屬水平上，白色（BY）、黑色（HY）和雙色地膜覆蓋（SY）處理分別篩選出15 個、1 個和23個主要差異類群。隨后又到這3 個處理篩選出的差異類群中去篩選其共有類群，以求找到各處理對植煙土壤理化性質影響較大的特征菌屬。結果表明，3 個處理不存在相同的共有菌屬，但從白色（BY）和雙色地膜覆蓋（SY）處理的類群中篩選出了3 個共有類群（表5），且這3 個類群菌均屬于變形菌門（Proteobacteria）、分屬于鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、伯克霍爾德菌科（Burkholderaceae）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）。

表5 BY 和SY 處理共有菌屬類群Table 5 Common rhizosphere bacterial community indicators of BY and SY

2.5 細菌群落與土壤理化性質關系

通過冗余分析，我們發現細菌群落與土壤理化性質之間存在顯著聯系。箭頭長度代表因素影響效果：箭頭越長，影響效果越大；箭頭間的角度表明各因素間的相關性：銳角表明兩因素呈正相關關系，鈍角則表示負相關。由圖3 可知，基本理化性質中的土壤溫度（Tem）和堿解氮（A-N）以及中、微量元素中的有效鐵（A-Fe）、總鐵（T-Fe）、有效銅（A-Cu）和總銅（T-Cu）是影響細菌門水平上群落結構的主要因素。圖3A中冗余分析的前兩個軸解釋了土壤細菌門水平上群落結構與基本理化性質之間66.93%的變異，RDA 1 解釋了48.72% 的變異，RDA 2 解釋了18.21%的變異。圖3B 中冗余分析的前兩個軸解釋了土壤細菌門水平上群落結構與中微量元素之間64.66%的變異，RDA 1 解釋了37.63%的變異，RDA 2 解釋了27.03%的變異。

圖3 細菌群落和土壤理化性質間的冗余分析Fig. 3 Redundancy analysis (RDA) between bacterial communities and soil physicochemical properties

3 討論

3.1 全生育期覆膜栽培對烤煙經濟性狀的影響

生態環境決定煙葉質量特色，土壤、海拔及氣候等環境條件是影響烤煙產質量的重要因素。王全貞等［27］認為在海拔落差較大、降雨和氣溫差別較大、立體氣候明顯的煙區常年種植單一品種會面臨烤煙品種退化、病害加劇、產質量下降等問題。宜賓煙區作為典型的丘陵煙區，同樣面臨著海拔落差較大，立體氣候明顯等問題。因此，覆膜栽培作為一種可有效改善植煙土壤溫度、水分等田間小氣候的栽培措施，在當地被廣泛推廣應用。大量研究表明，地膜覆蓋栽培需在烤煙移栽后30～60 d 左右進行揭膜培土［28-29］。但也有研究指出，在高海拔、多雨煙區進行全生育期覆膜栽培對烤煙的生長發育及產值量是有利的［20-21］。本研究通過對比全生育期不同顏色地膜覆蓋處理和白色膜覆蓋適時揭膜對照間經濟性狀的差異，發現全生育期覆膜能顯著提高烤煙的產值量，這與孔德鈞等［20］研究結果一致，其開展研究的煙區為貴州威寧縣，海拔高度為1 800 m 左右，烤煙品種為紅花大金元，本研究選擇的煙區為四川興文縣，海拔高度為1 150 m 左右，烤煙品種為云煙87，自然氣候、土壤類型及烤煙品種不同等因素可能是兩者海拔相差較大，卻得出一致結論的重要原因。

3.2 全生育期地膜覆蓋對植煙土壤理化性質的影響

土壤是影響煙葉生長的重要生態條件之一，土壤質量是生產優質煙草的重要基礎，植煙土壤的理化性質將直接影響煙葉的產質量［30］。地膜覆蓋會顯著改變土壤濕熱特性、物理和化學環境，進而影響土壤元素的形成。本研究中，與揭膜對照（CK）相比，不同顏色覆膜處理可提高植煙土壤溫度，白色（BY）、雙色（SY）和黑色地膜覆蓋（HY）處理的平均溫度分別上升0.99 ℃、0.62 ℃和0.39 ℃。此外，使用白色地膜覆蓋會提高土壤表層含水率（0～10 cm），而使用雙色和黑色地膜覆蓋則會降低土壤表層含水率。這可能是由于白色地膜覆蓋處理增溫較高，導致深層土壤的水分蒸發加劇，然后在土壤表層遇塑料膜后冷凝回流形成，這說明地膜覆蓋會改變土壤小氣候（溫度和水分），進而影響土壤pH 值、有機物及其他養分循環。另有研究指出，地膜覆蓋對水土流動性較大土壤中的堿解氮和速效鉀具有富集作用［31］，這支持了Zhou 等［32］關于地膜覆蓋有利于玉米吸收土壤養分的發現。本試驗中，地膜覆蓋顯著增加了煙草成熟期植煙土壤中的總磷和總鉀含量，并顯著降低了堿解氮含量，這與前人的研究存在一定差異。本研究中，與對照組相比，黑色地膜覆蓋處理的土壤堿解氮和速效鉀在整個生育期呈下降趨勢，而有效磷則表現相反。有趣的是，也有研究表明，黑色地膜覆蓋可一定程度減少土壤中的堿解氮、有效磷和速效鉀［33］，這與本研究的結論相似。綜上，覆蓋物的顏色、覆蓋時間和作物類型對土壤養分含量的影響并不一致。

3.3 全生育期覆膜對細菌群落結構的影響

土壤微生物被廣泛用作衡量土壤質量的生物指標，細菌則是最豐富和多樣化的土壤微生物群體。在Maul 等［34］的研究中，土壤物理特性、養分有效性和覆蓋的塑料薄膜的變化會導致土壤微生物群落發生改變。本研究中，全生育期覆膜顯著降低了細菌群落的相對豐度（表4），這與在其他作物如玉米［19］、水稻［35］上的研究相一致。此外，在細菌門和屬水平上，對照和各處理間的優勢菌群也存在顯著差異。

土壤微生物群落的組成和分布受到土壤環境的影響，因此可以將其視為土壤質量變化的重要參考［36］。為明確植煙土壤環境對微生物群落結構的影響，找出煙草根際細菌群落結構與土壤環境因素之間的聯系，我們將微生物群落與各土壤環境因子進行了冗余分析（RDA）。前人研究表明，土壤堿解氮、有機物、pH 值和含水量是影響煙草根際土壤細菌群落的重要環境因素，但本研究結果表明，土壤溫度和堿解氮以及中微量元素中的有效鐵、總鐵、有效銅和總銅含量是影響細菌門水平上群落結構的主要因素，這與前人的研究結果存在一定差異。造成這種差異的原因很可能是本研究采用了全生育期覆膜栽培，而前人的研究是在烤煙生長中期適當時候進行了揭膜處理。

4 結論

全生育期覆膜栽培改變了植煙土壤理化性質，進而影響了土壤微生物群落的結構和豐度。本研究結果表明，全生育期覆膜可顯著提高烤煙產值量，產量和產值分別較對照提高了13.33%～21.36%和15.87%～20.26%，經濟性狀最好的處理是黑白雙色膜覆蓋。在土壤理化性質方面，全生育期覆膜可提高土壤溫度（1.62%～4.11%）、全鉀（0.70%～5.58%）、全磷（3.11%～27.33%）、全鐵（1.73%～4.81%）和有效銅（4.76%～19.05%）含量，降低土壤pH 值（3.02%～4.80%）、堿解氮（10.45%～14.50%）、有效鐵（3.36%～13.43%）、全銅（2.25%～9.32%）和全鋅（7.69%～10.01%）含量。在細菌群落結構方面，全生育期覆膜明顯抑制了植煙土壤細菌的相對豐度，對照的Chao 1 指數分別比白色、雙色、黑色地膜覆蓋處理高14.09%、24.20%、24.81%。冗余分析結果表明，影響細菌門水平上群落結構的主要理化因子為土壤溫度、堿解氮、有效鐵、總鐵、有效銅和總銅含量。