短期飼喂縮合單寧對大規格大口黑鱸生長性能和肝臟健康的影響

彭 凱，邱建強,2，徐友良，黃文慶，王玉璽，黃 文

（1.廣東省農業科學院動物科學研究所/農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室/廣東省農業科學院水產研究中心/廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.華中農業大學水產學院，湖北 武漢 430070；3.肇慶市佰仕科生物科技有限公司，廣東 肇慶 526105；4.廣州飛禧特生物科技有限公司，廣東 廣州 510640；5.加拿大農業與農業食品部萊斯布里奇研究中心，阿爾伯塔 萊斯布里奇 T1J4B1）

【研究意義】縮合單寧是由黃烷-3-醇或黃烷3,4-二醇單體聚合而成的多酚類化合物，其廣泛存在于植物界，是一類化學結構和生物活性特殊的植物次級代謝產物［1］。由于高劑量縮合單寧阻礙動物對營養物質的有效利用，甚至造成機體代謝紊亂、器官損傷，因此，長期以來縮合單寧被視為“抗營養因子”［2］。但近年來研究發現，低劑量縮合單寧具有促進動物健康的潛在應用價值［3］，歸因于低劑量縮合單寧所表現的抑菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、促進糖脂代謝等生物活性。后抗生素時代，植物提取物縮合單寧的生物活性逐漸受到廣泛關注，適量縮合單寧不僅不影響動物的生長性能，還能發揮抗氧化、免疫調節、降脂、調節腸道微生態等功效，具有良好的“替抗”應用前景［3］。因此，開展縮合單寧飼料添加劑應用研究對提升養殖動物的健康和品質具有現實意義。

【前人研究進展】目前縮合單寧在動物生產上的研究主要集中于畜禽動物，其作為水產飼料添加劑的研究雖然不多，但已有研究表明，縮合單寧在草魚［4-5］、中國花鱸［6-10］、日本花鱸［11-14］、凡納濱對蝦［15-16］上表現出抗氧化、抗炎、調節腸道微生態平衡等積極作用。肝臟是魚類重要的代謝器官和免疫器官，也是維持魚類生理機能最核心的器官之一，因此肝臟健康對魚類生長和抗逆至關重要。適量縮合單寧還能降低草魚［5］和美洲鰻鱺［17］的肝臟脂肪水平，維持肝臟健康。【本研究切入點】大口黑鱸（Micropterus salmoides），又名加州鱸，屬于典型的肉食性魚類，因其生長快、骨刺少、營養美味、養殖經濟效益高而深受市場和消費者青睞。據中國漁業統計年鑒數據顯示，2022 年我國淡水養殖的大口黑鱸產量高達70 萬t［18］，在我國淡水漁業發展中起重要支撐作用。然而，高密度養殖模式下出現的大口黑鱸代謝紊亂、口感油膩、病害頻發等問題亟待解決。此外，由于飼養不當容易導致“脂肪肝”問題（大多在養殖中后期的大規格大口黑鱸中出現），這不僅不利于大口黑鱸的生存和健康，還將導致魚肉品質降低［19］，使養殖蒙受經濟損失。目前，縮合單寧應用于緩解大規格大口黑鱸“脂肪肝”以及促進動物肝臟健康的研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗通過在大口黑鱸飼料中添加0.1%、0.2%和0.4%的縮合單寧，探究縮合單寧的適宜添加量及其對大規格大口黑鱸生長性能、血清代謝物、肝臟組織結構及脂肪含量的影響，旨在為縮合單寧在大口黑鱸飼料中的應用以及大口黑鱸健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2022 年10—11 月在廣東省農業科學院白云區農業科學試驗中心的池塘網箱養殖系統中進行。供試的大規格大口黑鱸購于佛山市順鋒漁聯水產有限公司，于網箱中暫養2 周以適應養殖環境，暫養期間投喂商品飼料（購于佛山市南海區杰大飼料有限公司）。本試驗采用的縮合單寧來源于葡萄籽（純度≥95%），購于肇慶市佰仕科生物科技有限公司。

1.2 飼料配制

基礎飼料（G1）的原料組成及實測營養水平見表1。在G1 基礎上分別添加0.1%（G2）、0.2%（G3）和0.4%（G4）的縮合單寧配制試驗飼料。全部飼料原料粉碎過孔徑250 μm 的標準篩，維生素和礦物質預混料等微量組分采用逐級擴大法混勻，縮合單寧經蒸餾水溶解后直接添加到原料中。全部飼料原料經混合機混勻，采用SLX-80型雙螺桿擠壓膨化機制成膨化顆粒飼料（直徑2 mm），經55 ℃烘干后冷卻至室溫，裝入密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存備用。

表1 基礎飼料組成及營養水平（干物質基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(Dry matter basis)

1.3 試驗設計與飼養管理

暫養結束后，選取初體重為510（± 10.4）g 的大規格大口黑鱸600 尾，隨機分為4 組，每組3 個網箱（長1.5 m×寬1.5 m×高3 m），每個網箱50 尾魚。分別投喂1.2 的4 種飼料，采用飽食投喂方法，每天定時投喂2 次（8：00 和18：00），記錄水溫、水質、投喂量和死亡情況，試驗周期為30 d。試驗期間水溫為26（± 3）℃，pH 7.6～8.0，氨氮含量≤0.1 mg/L，亞硝酸鹽含量≤0.01 mg/L，溶氧含量＞5.0 mg/L。

1.4 樣品采集與分析

1.4.1 生長性能指標測定 試驗結束前24 h禁食，統計每個網箱中大口黑鱸的總數量和總體重，計算存活率、增重率、特定生長率、采食量和飼料系數。每缸隨機取3 尾魚，解剖并分離腹腔內的脂肪進行稱重，計算腹脂率。

存活率（%）=100×末尾數/初始尾數；

增重率（%）=100×（末體重-初始體重）/初始體重；

特定生長率（%/d）=100×（ln 末體體重-ln初始體重）/飼養天數；

采食量（g/尾）=攝食飼料總量/〔(初始尾數+終末尾數)/2〕；

飼料系數=攝食飼料總量/（末體重-初始體重）；

腹脂率（%）=100×腹腔脂肪總量/末體重。

1.4.2 血清代謝物測定 從每個網箱隨機取10 尾魚，用40 mg/L 間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）麻醉，于尾靜脈處采集血液，室溫下靜置2 h 后離心（3 500 r/min，10 min）制備血清，置于-20 ℃冰箱中保存，用于血清代謝物分析。血清代謝物如白蛋白、球蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等采用全自動生化分析儀（日立7600，日本）測定。

1.4.3 肝臟組織結構觀測 從每個網箱隨機取6尾魚，解剖取肝臟組織，先用數碼相機拍照，隨后將肝臟組織完全浸沒于4%多聚甲醛溶液中，放置48 h 進行組織固定，制作石蠟切片，采用H&E 染色法染色，于顯微鏡下拍照并觀察肝臟的組織形態。

1.4.4 肝臟脂肪含量測定 從每個網箱隨機取6尾魚，解剖取肝臟組織并完全浸沒于4%多聚甲醛溶液中，放置48 h 進行組織固定，然后脫水、石蠟包埋、切片（厚度8 μm）、油紅O 染色、拍照，用于肝臟中脂滴面積比的分析。從每個網箱另取6 尾魚，解剖取肝臟組織，采用乙醚抽提法（GB/T 6432-2006）分析肝臟粗脂肪含量。

1.5 數據統計與分析

采用SPSS 17.0 統計軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan氏法均值多重比較法對試驗結果的差異顯著性進行分析，若不滿足方差齊性則采用Dunnett-T3 檢驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸生長性能的影響

飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸生長性能的影響如圖1 所示。各組之間大口黑鱸的采食量、增重率和特定生長率無顯著差異。與G1組相比，G2 和G3 組存活率無顯著差異，G4 組存活率顯著下降15.79%（P＜0.05）；G2、G3、G4 組腹脂率顯著下降12.03%、16.18%、13.69%（P＜0.05）；G2、G3 組飼料系數無顯著差異，G4 組飼料系數顯著升高17.44%（P＜0.05）。

圖1 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸生長性能的影響Fig. 1 Effects of dietary condensed tannins on growth performance of large-sized Micropterus salmoides

2.2 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸血清代謝物的影響

飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸血清代謝物的影響如表2 所示。各組之間大口黑鱸的血清白蛋白、球蛋白、高密度脂蛋白膽固醇的含量及谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶的活性無顯著差異。與G1 組相比，G2、G3 組血清葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯含量無顯著差異，而G4 組血清葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯含量則分別顯著下降49.73%、28.46%、35.71%（P＜0.05）；G2 組血清低密度脂蛋白膽固醇含量無顯著差異，G3、G4 組血清低密度脂蛋白膽固醇含量分別顯著下降38.71%、51.61%（P＜0.05）。

表2 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸血清代謝物的影響Table 2 Effects of dietary condensed tannins on serum metabolites of large-sized Micropterus salmoides

2.3 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟表觀形態和組織結構的影響

飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟表觀形態和組織結構的影響分別如圖2 和圖3 所示。由圖2 可見，G1 和G2 組大口黑鱸的肝臟呈現不同程度的“花肝”現象，G3 和G4 組肝臟顏色鮮紅、形態正常。圖3 顯示G1 組肝細胞空泡化程度高，局部出現炎癥浸潤現象；G2 組肝細胞有輕微的空泡化現象，局部出現炎癥浸潤；G3和G4 組肝細胞形態結構正常，未見明顯的炎癥浸潤。

圖2 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟表觀形態的影響Fig. 2 Effects of dietary condensed tannins on the livermorphology of large-sized Micropterus salmoides

圖3 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟組織結構的影響（H&E 染色，× 200）Fig. 3 Effects of dietary condensed tannins on liver histomorphology of large-sized Micropterus salmoides(H&E staining,× 200)

2.4 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟脂肪含量的影響

飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟脂肪分布、脂肪含量及脂滴面積比的影響分別如圖4 和圖5 所示。由圖4 可見，肝臟經染色后脂質呈紅色，細胞核呈藍色，隨著飼料中縮合單寧含量的增加，肝臟中代表脂質的染色面積顯著降低。與G1 相比，G2、G3 和G4 組大口黑鱸的肝臟脂肪含量分別顯著降低9.52%、10.84%、11.25%（P＜0.05），G3 和G4 組肝臟脂肪含量分別顯著低于G2 組1.45%、1.91%（P＜0.05）；大口黑鱸肝臟脂滴面積比由大到小依次為G1（4.32%）＞ G2（0.76%）＞ G3（0.57%）＞ G4（0.20%）（P＜0.05）（圖5）。

圖4 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟脂肪分布的影響（油紅O 染色，× 200）Fig. 4 Effects of dietary condensed tannins on liver lipid distribution of large-sized Micropterus salmoides(Oil red O staining,× 200)

圖5 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟脂肪含量和脂滴面積比的影響Fig. 5 Effects of dietary condensed tannins on liver fat content and lipid droplet area ratio of large-sized Micropterus salmoides

3 討論

3.1 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸生長性能的影響

縮合單寧屬于天然多酚類化合物，作為功能性飼料添加劑僅在草魚［4-5］、中國花鱸［6-10］、日本花鱸［11-14］、凡納濱對蝦［15-16］、美洲鰻鱺［17］等少數水產動物品種上有相關研究，其對水產動物生長和健康影響的研究仍相當缺乏。本研究結果表明，各組之間大口黑鱸的采食量、增重率和特定生長率均無顯著差異，說明飼料中添加0.1%～0.4%縮合單寧不影響飼料的適口性，也不會對大口黑鱸的生長速率造成負面影響。0.1%和0.2%縮合單寧對大口黑鱸的存活率和飼料系數無顯著影響，表明適量的縮合單寧（0.1%、0.2%）并不影響大口黑鱸的存活與飼料轉化效率，而0.4%劑量組大口黑鱸的飼料系數顯著下降，可能與高劑量縮合單寧的抗營養特性有關。高劑量縮合單寧被視為“抗營養因子”［1］，歸因于縮合單寧具有較強的蛋白質結合能力，亦可與消化酶、碳水化合物、礦物質結合形成復合物，從而阻礙營養物質的消化和利用［20］。本試驗結果與縮合單寧在花鱸［6］上的研究結果一致，即低劑量縮合單寧不影響成活率和飼料系數，而高劑量縮合單寧抑制飼料養分的消化和吸收，損傷腸道組織。海鱸［14］相關研究也表明，低劑量的葡萄籽縮合單寧不影響海鱸的生長性能和腸道組織結構，但高劑量縮合單寧造成腸道胰蛋白酶和刷狀緣酶的活性下降。本試驗中，0.4%劑量組大口黑鱸存活率顯著下降可能歸因于高劑量縮合單寧對機體造成損傷，已有研究表明高劑量縮合單寧不僅可顯著破壞草魚［4］、花鱸［6,10］、凡納濱對蝦［16］腸道組織結構，還可通過其代謝產物進入血液循環損害機體其他器官［21］。

3.2 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸血清代謝物的影響

血液代謝物水平可間接反映魚體的健康狀況。本研究結果表明，大口黑鱸血清葡萄糖、膽固醇及甘油三酯的含量隨著縮合單寧添加量的升高而下降，并在0.4%劑量時差異顯著，說明高劑量縮合單寧具有促進糖脂代謝的效果。這與縮合單寧應用于花鱸［7］上的研究結果一致，即0.1%、0.2%縮合單寧可促進花鱸血清糖脂代謝。低密度脂蛋白膽固醇的作用是將肝臟合成的內源性膽固醇運輸到肝外組織（如轉移至血液），而本研究中大口黑鱸血清低密度脂蛋白膽固醇含量隨著縮合單寧劑量的升高而降低，并在0.2%劑量時差異顯著，說明縮合單寧可能抑制了膽固醇由肝臟向血液轉移，從而導致血清中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量下降。此外，除血清糖脂含量降低外，腹脂率和肝脂含量也顯著降低。縮合單寧添加組大口黑鱸的腹脂率均顯著降低，肝臟油紅O 染色結果也說明縮合單寧可顯著降低肝臟脂滴面積比，緩解大口黑鱸的“脂肪肝”現象，上述結果說明飼料中添加適量的縮合單寧對促進大口黑鱸糖脂代謝具有積極作用。相關研究表明，縮合單寧能夠促進水產動物的糖脂代謝，如低于2 g/kg 的縮合單寧可促進中國花鱸的糖脂代謝［7］，飼料中添加0.1%縮合單寧可改善海鱸由高碳水化合物引起的生長性能下降及血糖水平升高，歸因于縮合單寧對海鱸肝臟糖代謝相關酶（如葡萄糖激酶、丙酮酸激酶）活性及基因表達的促進作用［11］。體外研究發現，縮合單寧可通過離子相互作用、疏水相互作用和分子間氫鍵直接與膽固醇結合，且其結合能力隨縮合單寧的濃度升高而增強［22］。另有研究指出，縮合單寧還可通過與脂肪酶、膽固醇酯酶、膽汁酸的相互作用來減少脂質的消化［23-24］。Oliveira 等［25］發現，縮合單寧除了通過抑制α-淀粉酶阻礙葡萄糖吸收外，還能通過抑制胰脂肪酶從而間接抑制甘油三酯的吸收。綜上，一方面縮合單寧可影響糖脂的消化和吸收進程，從而降低機體對糖脂的攝入量；另一方面縮合單寧可介導糖脂代謝途徑、相關酶活性及基因表達，從而促進糖脂分解代謝并降低血液中的糖脂水平。

3.3 飼料中添加縮合單寧對大規格大口黑鱸肝臟組織結構和脂肪含量的影響

組織結構觀察能夠直接反映動物器官的生理狀態和健康程度，是判斷組織器官是否發生病變的常用手段。本研究結果表明，飼料中添加縮合單寧有利于促進肝臟健康，緩解“花肝”現象。Kang 等［26］報道，飼料中添加高劑量縮合單寧對大口黑鱸的肝臟造成氧化損傷，并誘發炎癥反應。與之相反，低劑量縮合單寧卻表現出緩解氧化應激和炎癥損傷的效應，這與本研究結果相一致，即隨著縮合單寧添加量上升，大口黑鱸“花肝”問題得到改善，且肝臟的空泡化、炎癥浸潤現象也減弱。相似地，縮合單寧還可緩解海鱸黃曲霉毒素B1中毒［8］、高碳水化合物攝入［11］、銅離子應激［12］、缺氧脅迫［13］引起的氧化損傷，增強肝臟的抗氧化能力。本試驗中縮合單寧改善大口黑鱸肝臟健康的原因可能是縮合單寧增強了肝臟的抗氧化功能，后續研究有待進一步證實。本試驗結果表明，隨著縮合單寧添加量的升高，大口黑鱸肝臟脂肪含量和脂滴面積比均顯著下降，說明縮合單寧抑制了肝臟脂肪的沉積，其機制可能與縮合單寧調控脂代謝相關酶的活性、基因表達量及抑制脂肪細胞的生存有關。如顧艾鑫等［27］研究發現，縮合單寧通過下調脂肪酸合成酶和過氧化物酶體增殖劑激活受體PPAR γ 的基因表達水平，或者通過抑制Wnt3a/β-catenin 信號通路從而破壞脂肪細胞的增殖和分化，從而抑制脂肪合成。Han 等［28］報道，縮合單寧通過削弱胰島素抵抗、抗氧化應激作用，使腸道微生態及屏障功能恢復正常，進而抑制肝炎及肝臟脂肪蓄積。相似地，縮合單寧對海鱸肝臟糖酵解和糖異生酶的活性及基因表達具有積極影響［11］。在陸生動物上，縮合單寧對高脂誘導的鼠表現出改善糖脂代謝的效果，且肝臟脂肪沉積下降［29-30］，這與本試驗結果相一致。

4 結論

在本研究條件下，較高添加劑量（0.4%）縮合單寧導致大規格大口黑鱸存活率顯著下降，且飼料系數顯著升高，但促進糖脂代謝作用明顯，腹脂率顯著下降，血清葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯的含量及肝臟脂肪含量均顯著下降。飼料中添加適量（0.1%和0.2%）縮合單寧對大規格大口黑鱸存活率、增重率、特定增長率和飼料系數無顯著影響，但能降低腹脂和肝脂含量，其中以0.2%縮合單寧促進糖脂代謝作用效果較好。此外，隨著縮合單寧添加量升高，大規格大口黑鱸肝臟健康問題逐漸改善，肝臟組織空泡化、炎癥浸潤現象減輕。以肝臟健康為評價依據，縮合單寧在大口黑鱸飼料中的適宜添加量為0.2%。