豬巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 檢測方法的建立

徐翔飛, 黃盼, 崔雪梅, 黃葉娥, 季權安, 韋強, 李科, 宋厚輝, 鮑國連*, 劉燕*

(1.浙江農林大學 動物科技學院 動物醫學院, 浙江 杭州 311300; 2.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所, 浙江 杭州 310021)

豬多殺性巴氏桿菌 (Pasteurellamultocida,Pm) 屬于革蘭氏陰性菌, 大小約為0.3 μm ×0.2 μm。豬感染后可導致豬肺疫, 是豬常見的傳染性呼吸道疾病, 傳播途徑為機械性傳播, 可引起出血性敗血癥, 發病后無癥狀, 迅速死亡。Pm 易被殺死, 在消毒劑或太陽下迅速死亡, 一般情況下, Pm 寄生于呼吸道黏膜和尿道黏膜, 并不會致病, 在宿主免疫力降低時, Pm 就可以感染并致病[1-3]。波 氏 桿 菌 (Bordetellabrcmchiseptica, Bb)又稱支氣管敗血性巴氏桿菌, 是造成豬萎縮性鼻炎(atrophic rhinitis of swine, AR) 的主要細菌, 是一種革蘭氏陰性菌, 無芽孢、鞭毛, 需氧菌, 大小為0.5 μm×2 μm。波氏桿菌的主要毒力因子為絲狀血凝素 (filamentous hemagglutinin, FHA)、百日咳桿菌黏附素 (pertactin)、菌毛 (fimbriae) 等。根據Bb 的抗原性, 生長特性等可將其分為3 種菌相。傳播途徑為空氣、接觸、排泄物等傳播。Bb 可存在于呼吸道黏膜, 一般不發病, 在免疫力降低時會導致發病, 在上呼吸道和肺臟感染, 引起出血性敗血癥, 感 染 后 鼻 出 血 不 止、呼 吸 困 難、打 鼾等[4-6]。巴氏桿菌和波氏桿菌均屬呼吸道感染常見病原菌, 且二者常混合感染, 病癥相似, 嚴重影響我國養豬業的發展, 而常用的檢測方法速度慢, 靈敏度低, 貽誤疾病的治療與防疫, 因此, 建立巴氏桿菌和波氏桿菌和2 者混合感染的檢測方法具有重要意義。

本文根據巴氏桿菌和波氏桿菌保守序列16S rRNA 基因為靶基因設計了2 對引物, 建立了快速診斷巴氏桿菌、波氏桿菌和混合感染的雙重PCR診斷方法。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

實驗所用鏈球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、巴氏桿菌及副豬嗜血桿菌從中國獸醫微生物菌種保藏管 理 中 心 ( China Veterinary Culture Collection Center, CVCC) 購買, 胸膜肺炎放線球菌、波氏桿菌為本實驗室保存菌株。

1.2 主要試劑

DL 2 000 DNA Marker 購自寶日醫生物技術(北京) 有限公司; GreenTapMix 酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司; 胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar, TSA)、胰 蛋 白 胨 大 豆 肉 湯(tryptic soy broth, TSB) 等培養基購自賽默飛公司。犢牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物的設計與合成

在NCBI 上分別下載巴氏桿菌和波氏桿菌保守序列16S 基因, 應用Primer 3.0 Plus 軟件在線設計2 對引物, 巴氏桿菌引物核苷酸序列為: P1, 5′-ACGGGTGAGTAATGCTTGGG-3′; P2, 5′-GCAGGC TTGGTAGGCCTTTA-3′, 擴增片段大小為172 bp;波氏桿菌引物核苷酸序列為: P3, 5′-CGGGGGATAACTACGCGAAA-3′; P4, 5′-ACACAC TCTAGCCCGGTAGT-3′, 擴增片段大小為519 bp,引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.4 模板的制備

將保存的菌株復蘇, 37 ℃培養過夜的菌液,取1 mL 和400 μL 裂解液和蛋白酶K 8 μL 混合,金屬浴56 ℃ 40 min, 再將溫度調到100 ℃, 溫度達到100 ℃時, 再持續10 min, 待溫度降到室溫取出, 放4 ℃保存。作為模板, 將巴氏桿菌和波氏桿菌菌液混合培養作為雙重PCR 模板[7]。

1.5 PCR 擴增

設計引物時的退火溫度, 初步建立分別擴增巴氏桿菌和波氏桿菌的反應程序: 95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30 個循環, 72 ℃ 10 min,擴增產物保存于4 ℃。采用50 μL 擴增體系。PCR擴增結束后, 1%瓊脂糖凝膠電泳, 在紫外發光凝膠成像系統下觀察結果。

1.6 PCR 擴增產物的測序和比對

分別將巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 擴增產物純化后送浙江尚亞生物有限公司進行測序, 并對測序結果再次進行BLAST 比對。

1.7 PCR 條件優化

根據1.5 節中的擴增條件為基礎, 保持單一變量, 進行PCR 的擴增, 退火溫度設為50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 ℃; 引物 濃度設為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 μL; 退火時間設為10、20、30、40、50、60、90 s, 篩選2 個PCR 的最佳擴增條件和反應程序。

1.8 巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 的特異性檢驗

根據1.7 節中優化后的條件, 分別擴增巴氏桿菌、波氏桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌、鏈球菌、胸膜肺炎放線球菌以檢驗單一PCR 的特異性。

1.9 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 條件優化

以1.8 節中優化后的PCR 為基礎, 建立巴氏桿菌和波氏桿菌的雙重PCR, 保持單一變量對,雙重PCR 條件進行優化, Pm+Bb 引物濃度設為:1 μL+1 μL、1.5 μL+1.5 μL、1 μL+1.5 μL、1.5 μL+1 μL, 退火溫度設置梯度50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 ℃, 延伸時間: 10、20、30、40、50、60 s。篩選雙重PCR 的最佳擴增條件和反應程序。

1.10 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 特異性檢驗

根據上述1.9 節中優化后的雙重PCR, 用巴氏桿菌和波氏桿菌的雙重PCR 檢驗巴氏桿菌和波氏桿菌混合物、副豬嗜血桿菌、產氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、鏈球菌以檢驗雙重PCR 的特異性。

1.11 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 產物測序及比對

將巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 產物送至浙江尚亞生物有限公司測序, 測序結果進行BLAST比對。

1.12 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 重復性實驗

用同一模板擴增3 次, 以此驗證巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 的重復性效果。

1.13 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 方法的臨床應用

采集來自浙江不同豬場送檢的病料, 對63 例呼吸道癥狀的病豬的鼻拭子和肺臟進行細菌分離鑒定, 并用建立的巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 檢測方法和PCR 引物同時進行擴增, 統計檢測結果,比較2 種檢測方法的一致性。

2 結果與分析

2.1 PCR 擴增結果

分別用對應引物擴增巴氏桿菌和波氏桿菌, 擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后, 利用紫外發光凝膠成像系統記錄結果, 結果如圖1 所示, 實驗結果與預期相同。

圖1 巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 擴增結果

2.2 PCR 擴增產物的測序和比對

分別將巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 擴增產物純化后送浙江尚亞生物有限公司進行測序, 并對測序結果再次進行BLAST 比對, 結果如表1 所示。

表1 PCR 擴增結果在NCBI 比對結果

2.3 PCR 反應的最佳條件

通過單一變量的原則, 分別進行PCR 擴增,Pm-PCR 退火溫度控制在50～66 ℃, 退火時間設在20～60 s, 引物濃度添加量在1.0～2.0 μL 均能擴出目標條帶 (圖2 中A、B、C); Bb-PCR 退火溫度控制在50～67 ℃, 退火時間設在20～60 s, 引物濃度添加量在0.6～2.0 μL 均能擴出目標條帶(圖3 中A、B、C)。

圖2 巴氏桿菌PCR 擴增條件優化

圖3 波氏桿菌PCR 擴增條件優化

2.4 巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 的特異性檢驗

用優化后的巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 分別擴增巴氏桿菌、波氏桿菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、產氣莢膜梭菌、鏈球菌, 以此分別檢驗巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 的特異性。除所需檢驗的目標片段能擴出特異性條帶, 其他菌檢測結果均為陰性 (圖4)。

圖4 巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 特異性檢驗

2.5 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 條件優化

以2.4 節中優化后的PCR 為基礎, 建立巴氏桿菌和波氏桿菌的雙重PCR, 保持單一變量對, 雙重PCR 條件進行優化, 結果顯示, 退火溫度控制在50～64 ℃時, 雙重PCR 2 條目標條帶均能擴出,65～67 ℃時僅波氏桿菌可以擴出條帶, 退火時間設在10～60 s 均能擴出2 條清晰條帶, 引物濃度添加量在1 μL+1 μL、1.5 μL+1.5 μL、1 μL+1.5 μL、1.5 μL+1 μL 均能擴出2 條目標條帶(圖5)。

圖5 巴氏桿菌+波氏桿菌雙重PCR 條件優化

2.6 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 特異性檢驗

用2.5 節中優化后的巴氏桿菌和波氏桿菌的雙重PCR 檢驗巴氏桿菌和波氏桿菌混合物、巴氏桿菌、波氏桿菌、副豬嗜血桿菌、產氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、鏈球菌以檢驗雙重PCR 的特異性。結果與預期相同 (圖6)

圖6 巴氏桿菌+波氏桿菌雙重PCR 特異性檢驗

2.7 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 產物測序及比對

將巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 擴增產物送至浙江尚亞生物有限公司測序, 將測序結果進行BLAST 比對, 與相應基因進行比對, 結果顯示與原基因相似度高 (表2)。

表2 雙重PCR 擴增結果在NCBI 比對結果

2.8 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 重復性實驗

用同一模板擴增3 次, 以此驗證巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 的重復性效果, 結果表明, 該方法重復性較好 (圖7)。

圖7 巴氏桿菌+波氏桿菌雙重PCR 重復性實驗

2.9 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 方法的臨床應用

對63 例呼吸道癥狀的病豬的鼻拭子和肺臟進行細菌分離, 其中10 份樣品檢測出巴氏桿菌, 8份樣品檢測出波氏桿菌, 2 份為巴氏桿菌和波氏桿菌混合感染。用Lichtensteiger 等[8]和Hozbor 等[9]建立的PCR 檢測方法同樣檢測出10 份樣品為巴氏桿菌, 8 份樣品為波氏桿菌, 2 份為巴氏桿菌和波氏桿菌混合感染, 與其符合率為100% (圖8)。

圖8 巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR 的臨床應用

3 討論

巴氏桿菌和波氏桿菌均為引起豬呼吸道病綜合征 (PRDC) 的細菌性病原, 均可引發其他呼吸道病原菌的原發性或繼發性感染, 同時二者常混合感染, 不僅增加了病原菌的危害程度, 也給疾病的檢測和診斷工作增加了難度[10-11]。巴氏桿菌和波氏桿菌檢測方法中細菌分離為最常用的檢測方法, 準確率高, 是指導臨床用藥的重要手段, 但該方法實驗周期長, 培養過程易污染, 故該方法不適用于檢測初期[1,12]。隨著免疫學的發展, 血清學診斷方法理論上特異性好, 檢測速度快, 如依靠抗原抗體之間的特異性反應的酶聯免疫吸附 (ELISA) 檢測方法, 該方法的檢測時間短, 靈敏度高, 特異性好。但該方法只能檢測體內抗體水平, 并不能判斷為野生毒株感染, 同時抗體一般在野生毒株感染一段時間以后才會產生[13-14]。故該方法在檢測巴氏桿菌和波氏桿菌感染方面具有局限性。PCR (聚合酶鏈式反應) 檢測方法作為細菌檢測最常用的手段,重復循環高溫變性、低溫退火、中溫延伸3 過程,每個循環需1～4 min, 目標基因指數增加, 1～2 h便可將目的片段擴大幾百萬倍, 故該方法速度快,靈敏度高[15]。

本文根據巴氏桿菌和波氏桿菌保守序列16S rRNA 基因為靶基因, 應用 Primer 3.0 Plus 軟件設計了2 對引物, 并進行BLAST 分析引物特異性,巴氏桿菌引物可擴出172 bp 的目標片段, 波氏桿菌引物可擴出519 bp 的目標片段。對巴氏桿菌和波氏桿菌PCR 條件進行優化, 并將單一PCR 擴增產物送測序, 測序結果進行BLAST 比對, 結果顯示單一PCR 與原基因相似度很高。對單一PCR 進行特異性檢驗, 結果顯示, 僅所需檢測的目標菌株呈陽性, 其他菌株擴增均呈陰性, 說明單一PCR的特異性較好。將兩個單一PCR 合并為巴氏桿菌和波氏桿菌雙重PCR, 對雙重PCR 擴增條件和反應程序進行優化, 將雙重PCR 產物送測序, 結果顯示, 雙重PCR 產物序列與原基因相似度很高。對雙重PCR 進行特異性檢驗, 巴氏桿菌和波氏桿菌混合菌株、巴氏桿菌、波氏桿菌均呈陽性, 副豬嗜血桿菌、產氣莢膜梭菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、鏈球菌均為陰性, 說明雙重PCR 特異性較好。將該結果與已報道的PCR 方法比較, 符合率為100%, 表明本方法準確率較高, 有良好的臨床應用價值, 期望該方法有利于巴氏桿菌和波氏桿菌病發生時進行快速診斷和流行病學調查。