浙貝母灰霉病病原菌的生物學特性及田間生物農藥篩選

何曉嬋, 周小軍, 龍安琪, 謝海鵬, 李玲, 朱浩, 朱麗燕*

(1.金華市農業科學研究院, 浙江 金華 321000; 2.浙江農林大學, 浙江 杭州 311300)

浙貝母為百合科植物, 是浙江地道藥材 “浙八味” 之一, 在國內外享有盛譽[1]。浙貝母的栽培歷史至今已有300 多年, 最早記載于東漢 《神農本草經》。目前主要種植在浙江、湖南、江蘇和安徽一帶[2], 其中浙江產區主要以鄞州、磐安、東陽為主,種植面積和產量占全國的90%左右, 常年種植面積約20 hm2, 年產商品產量約9 000 t[3]。

然而, 隨著浙貝母的種植栽培面積不斷增大,浙貝母的病害問題也日漸突出。浙貝母主要病害有灰霉病、黑斑病、炭疽病、干腐病等, 其中以灰霉病最為嚴重[4-5]。每年浙貝母灰霉病發病率都能達到82%以上[6], 對農戶造成近30%的效益損失。浙貝母灰霉病也叫 “眼圈病” “早枯病” 等[7],2017—2022 年浙江省磐安縣浙貝母灰霉病危害最為嚴重, 藥農對于浙貝母灰霉病普遍稱為 “難治之癥”。莖稈感染灰霉病后, 首先出現水浸狀斑塊, 表面逐漸褐變濕腐, 病情隨著濕度增大加重,開始出現灰色霉層, 天氣干燥時病莖呈現干腐狀態[3]。李吉二等[8]利用分子生物學技術將該病病原菌鑒定為灰葡萄孢菌 (Botrytiscinerea), 而非被認為的橢圓葡萄孢 [Botrytiselliptica( Berk.)Cooke]。李云山等[9]于1984 年對浙貝母灰霉病病原菌橢圓葡萄孢的生物學特性進行了探索, 分析了分生孢子形成與萌發、菌核萌發的最適溫度。但截至目前, 尚未見灰葡萄孢菌的生物學特性研究。劉玉紅等[5]調研發現, 浙貝母種植戶用于防治灰霉病的農藥種類繁多, 嘧霉胺、百菌清、腐霉利、異菌脲、多菌靈及代森錳鋅等農藥最為常見。朱麗燕建議, 在灰霉病未發生前或發生初期, 用嘧霉胺懸浮劑防治貝母灰霉病, 3 次藥后14 d 防治效果可達82.9%。鄧曹仁等[6]研究表明, 氟菌·肟菌酯、唑醚·氟酰胺這兩種殺菌劑對浙貝母灰霉病有較好的防治效果。蔡嘉慧首次報道了芽孢桿菌對浙貝母灰霉病有抑制作用。浙貝母能清熱散結, 化痰止咳, 是一味中藥材, 盲目和過度使用農藥可能會造成產品藥物殘留過高, 從而對浙貝母的質量安全造成隱患[7,11]。基于此, 本研究從不同溫度、pH 值、光照條件、碳氮源4 個方面, 探究不同條件下該病原菌的生物學特性, 并在浙貝母主產區開展浙貝母灰霉病生物農藥的篩選, 為日后浙貝母灰霉病病害預測預報和防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及病原菌的分離純化

2020 年5 月在浙江省金華市農業科學研究院基地采集浙貝母發病植株, 裝入樣品收集袋帶回實驗室, 采用組織分離法進行分離及純化獲得菌株[12]。

1.2 病原菌的生物學特性

1.2.1 不同光照對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

試驗共設完全光照 (光照 ∶ 黑暗= 24 h ∶0 h)、光暗交替 (光照∶黑暗=12 h ∶12 h) 和完全黑暗 (光照∶黑暗= 0 h ∶24 h) 3 個處理。將5 mm 菌絲塊接至PDA 培養基上, 每個處理4 皿,分別置于不同光照條件下培養4 d, 用十字交叉法測定菌落直徑后, 采用 Excel 軟件對試驗數據進行統計分析。

1.2.2 不同溫度對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

將直徑5 mm 的供試菌株菌絲塊接種至PDA平板上, 分別放置在溫度為7、22、25、28、30 和33 ℃的培養箱中培養, 每個處理4 皿。用十字交叉法測定菌落直徑, 采用 Excel 軟件對試驗數據進行統計分析。

1.2.3 不同pH 對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

將做好的PDA 分裝到10 個三角瓶中, 每瓶150 mL, 高溫高壓滅菌晾涼后, 后用HCl 和NaOH將其pH 值分別調成4、5、6、7、8、9、10、11,將直徑為5 mm 的菌絲塊接入到上述培養基中, 置于22 ℃下培養, 每個處理4 個重復, 用十字交叉法測定菌落直徑后, 采用Excel 軟件對試驗數據進行統計分析。

1.2.4 不同碳氮源對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

基礎培養基為Czapek, 不同碳源以相當于1 L Czapek 培養基中30 g 蔗糖含碳量取代其中的蔗糖而試驗, 以麥芽糖、葡萄糖、纖維素、木糖、甘露醇、果糖、可溶性淀粉作為碳源替換基本培養基中的蔗糖。不同氮源分別以尿素、硫酸銨、硝酸鈉、牛肉浸膏、甘氨酸、脯氨酸、氯化銨、胰蛋白胨為氮源。將直徑為5 mm 的菌絲塊接入到用以上培養基制作的平板中, 置于22 ℃下培養, 每個處理4個重復, 用十字交叉法測定菌落直徑后, 采用Excel 軟件對試驗數據進行統計分析。

1.3 田間藥劑防治試驗

1.3.1 試驗設計

試驗設置7 個處理, 3 次重復, 共21 個小區,每個小區面積20 m2, 采用隨機區組排列。處理如下: (1) 16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍液 (興農藥業 (中國) 有限公司); (2) 20%丁子香酚水乳劑1 500 倍 (江蘇劍牌農化股份有限公司);(3) 哈茨木霉菌3 億CFU·g-1可濕性粉劑300 倍(美國拜沃股份有限公司); (4) 1%蛇床子素水乳劑750 倍 (內蒙古清源保生物科技有限公司);(5) 1 000 億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑750 倍 (武漢科諾生物科技股份有限公司);(6) 500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍 (美國富美實公司); (7) 清水對照。

試驗在浙江省磐安縣冷水鎮進行, 試驗品種為浙貝1 號, 本試驗共計施藥3 次, 分別在2021 年3月10 日、2021 年3 月17 日、2021 年3 月25 日施藥。采用美豐農化背負式WS-16 型手動壓縮噴霧器。每667 m2用水量50 L。噴藥時以葉片正反面充分著藥又不滴液為準, 全株均勻噴霧。

1.3.2 調查與統計

于施藥期間目測觀察施藥后貝母的安全性。藥前對未發病的植株進行定點, 于末次施藥后20 d對每個小區定點植株進行藥效調查, 采用分級計數法, 調查全部葉片, 以每一葉片上病斑面積占整個葉面積的百分率分級。

葉片分級方法: 0 級: 無病; 1 級: 病斑較少,占葉面積5%以下; 3 級: 病斑較多, 占葉面積5%～30%; 5 級: 病斑較多, 占葉面積31%～50%;7 級: 病斑較多, 占葉面積50%以上; 9 級: 全葉枯死。

計算病情指數和防治效果。防治效果為空白對照區病情指數與處理區病情指數之差除以空白對照區病情指數再乘以100。

1.4 統計分析

采用Excel 2007 和SPSS 25.0 軟件對試驗數據進行統計分析, 并采用LSD 法進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 田間病株的采集及病原菌的分離

在自然發病的浙貝母植株上, 發病部位主要出現在浙貝母葉片和莖上, 發病部位有褐色病斑, 葉片有腐爛狀且附有白色霉層; 莖部嚴重時出現腐爛狀, 發病后期可見整株植株枯死。

發病初期, 葉片上首先出現淡褐色病斑, 呈水漬狀, 后逐漸擴大成橢圓形或不規則的黃褐色病斑, 葉片邊緣極易感病 (圖1 中A)。隨著病情的發展, 灰色病斑不斷擴大, 病株葉片發黃且變黑,整個葉片腐爛。濕度增大后, 病葉正反面均滋生灰色霉層 (圖1 中B)。最后, 整個植株倒伏并枯死(圖1 中C)。一般田塊發病率在20%, 嚴重田塊發病率達70%。

2.2 不同光照時間對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

為探索光照對浙貝母灰霉病病原菌生長的影響, 筆者測定了該病原菌在不同光照時間下的生長直徑。在12 h ∶12 h、0 h ∶24 h、24 h ∶0 h 下菌落生長直徑分別為7.90、8.07、5.50 cm (表1)。在0 h ∶24 h 與12 h ∶12 h 條件下, 病原菌菌落直徑生長差異不顯著 (P<0.05), 光照條件下, 病原菌菌落受到顯著抑制, 菌絲稀疏且菌落生長直徑慢(圖2)。結果表明, 適合浙貝母灰霉病病原菌的光照條件為全黑暗或光照∶黑暗=12 h ∶12 h。

圖2 不同光照對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

2.3 不同溫度對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

為了探索不同溫度對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響, 筆者對病原菌在不同溫度下的生長情況進行了觀察。病菌菌絲在7～28 ℃條件下均能生長, 超過28 ℃生長非常緩慢 (圖3)。在7、22、25、28 ℃溫度下培養5 d 后菌落直徑分別為1.83、3.93、2.68、0.83 cm。隨著溫度的升高, 病原菌菌絲生長速度加快, 22 ℃最利于菌絲生長, 其菌落平均直徑為3.93 cm, 極顯著高于其他溫度下的菌落直徑 (P<0.01) (表2)。結果表明, 22 ℃最利于菌絲生長。

表2 不同溫度對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

圖3 不同溫度對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

2.4 不同pH 值對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

為了探索不同pH 值對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響, 筆者對病原菌在不同pH 值下的生長情況進行了觀察。病原菌在pH 值 4～11 均能生長, 如表3 所示, 在同樣的培養時間內, pH 值為4～11 時菌落生長直徑分別為1.80、2.27、4.15、5.10、5.18、4.98、4.48、1.07 cm。其中, 當pH為7～9 時, 菌絲濃厚且菌落直徑最大, 菌落生長直徑顯著高于其他處理 (圖4)。

表3 不同pH 對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

圖4 不同pH 值對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

2.5 不同碳氮源對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

為了探索不同碳、氮源對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響, 筆者對病原菌在不同碳、氮源下的生長情況進行了觀察 (圖5、6)。從表4 可以看出, 在供試碳源中, 葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖作為碳源的基礎培養基較適合病原菌菌絲的生長, 菌落生長直徑分別為5.18、5.10、4.93 cm。而在以尿素為氮源的基礎培養基最不適合菌絲生長, 以硫酸銨、牛肉浸膏、脯氨酸、氯化銨、硝酸鈉和胰蛋白胨為氮源的基礎培養基最適合病菌菌絲生長, 菌落 生 長 直 徑 分 別 為 5.40、5.40、5.40、5.10、4.73、5.40 cm, 顯著高于以甘氨酸、尿素為氮源的基礎培養基 (表5)。

表4 不同碳源對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

表5 不同氮源對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

圖5 不同碳源對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

圖6 不同氮源對浙貝母灰霉病病原菌菌絲生長的影響

2.6 田間藥劑防治試驗結果

由表6 可以看出, 各藥劑處理區產量均顯著優于空白對照處理; 化學藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理產量較高, 顯著優于其他生物農藥處理及空白對照處理, 但與生物農藥16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍處理產量無極顯著差異。

表6 試驗測產結果

由表7 可以看出, 4 次藥后14 d 化學藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍防治浙貝母灰霉病效果最好, 防治效果達74.0%, 生物農藥16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍處理防治效果次之, 防治效果為60.0%, 極顯著低于化學藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理, 與20%丁子香酚水乳劑1 500 倍防治效果無顯著性差異; 生物農藥哈茨木霉菌3 億CFU·g-1可濕性粉劑300 倍、1%蛇床子素水乳劑750 倍、1 000 億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑750 倍處理防治效果顯著低于生物農藥16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍、20%丁子香酚水乳劑1 500 倍處理。

表7 不同生物農藥防治浙貝母灰霉病田間試驗結果

3 結論與討論

筆者發現, 灰霉病病原菌生長受環境條件影響較大, 病原菌不宜受光照, 與白曉的報道一致, 在連續黑暗的條件下適宜菌絲生長。其最適溫度在22 ℃, 與陳長卿等[14]的報道一致, 15～25 ℃適宜菌絲生長。最適合菌絲生長的pH 值在7～9。而從病原菌的碳氮源中發現, 最適宜菌絲生長的碳源為葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖, 氮源為硫酸銨、脯氨酸、氯化銨、硝酸鈉和胰蛋白胨, 以尿素為氮源的培養基最不適合菌絲生長, 與岳海梅等[15]的報道碳源為葡萄糖或果糖, 氮源為蛋白胨適宜菌絲生長一致。

浙貝母灰霉病通常在3 月開始發病, 4 月上旬至4 月下旬為發病高峰期[2], 與測得的生長條件一致, 通過實驗數據可以更好地確定防治適期, 進一步有效抑制其生長。通過田間試驗發現, 供試的6 種藥劑對浙貝母灰霉病均有一定的防治效果。化學藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理產量最高, 防治效果最好, 顯著優于其他生物農藥處理。從試驗結果可以看出, 各生物農藥對浙貝母灰霉病均有一定防治效果, 但防治效果有限, 16%多抗霉素可溶粒劑1 500 倍處理、20%丁子香酚水乳劑1 500 倍防治效果分別為60.0%、57.8%, 顯著低于化學藥劑500 g·L-1異菌脲懸浮劑750 倍處理,但顯著優于其他生物農藥。因此, 16%多抗霉素可溶粒劑、20%丁子香酚水乳劑可作為防治浙貝母灰霉病的備選生物農藥。