基于生物信息學方法的骨肉瘤預后相關甲基化調控差異表達基因篩選

戴 易 張志敏 岳 星 青恒臻 袁長深 段 戡 鄭杭彬

1.廣西中醫藥大學研究生院，廣西南寧 530022；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院骨科，廣西南寧 530023；3.聯勤保障部隊第九一〇醫院重癥監護病房，福建泉州 362000

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種間充質細胞源性惡性腫瘤，常見于兒童和青少年[1]。OS 好發于股骨遠端、脛骨和肱骨的近端[2]，患者常表現為疼痛、腫脹，甚者伴病理性骨折[1]。25%的OS 患者伴有癌細胞轉移，其中最常見轉移是肺部，其次是骨骼遠端[2-3]。目前，OS 無轉移患者5 年無事件生存率（event-free survival，EFS）約為70%，而轉移患者僅為30%[4]。OS 的治療措施主要包括化療和手術[5]，研究表明，化療聯合手術可顯著提高OS 生存率，然而，轉移性OS 預后生存較差，在治療中存在藥物副作用[6]。

表觀遺傳是指所有獨立于DNA 序列基因表達的調控機制，其主要過程為ATP 依賴型染色質重塑、非編碼RNA 調控、組蛋白修飾、DNA 甲基化[7]。其中DNA 甲基化是指在其轉移酶調控下，CpG 序列5-胞嘧啶選擇性添加甲基基團從而形成5-甲基胞嘧啶的共價化學修飾過程[8-9]。DNA 甲基化能改變染色體結構、DNA 構象、DNA 穩定性及蛋白質與DNA 相互作用方式，從而調控基因表達[10-11]。近年來研究表明，DNA 甲基化可能是各種惡性腫瘤潛在預后靶標[4]。在癌細胞中，腫瘤抑制基因啟動子區域高甲基化可以導致細胞異常增殖，從而引發癌癥[6]。此外，異常DNA 甲基化也與神經、免疫系統疾病、動脈粥樣硬化和骨質疏松有關[12]。本研究篩選OS 患者異常甲基化差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），目的是闡明DNA 甲基化在OS 進展中的作用，以期為治療OS 提供新靶標。

1 資料與方法

1.1 數據資料

在基因表達綜合數據庫中檢索得到芯片GSE36001和GSE36002，GSE36001 包含19 個骨肉瘤樣本與6個正常樣本，GSE36002 包含19 個甲基化骨肉瘤樣本與6 個甲基化成骨細胞樣本[13]。

1.2 OS 患者DEGs 及甲基化DEGs 篩選

利用R 語言篩選芯片DEGs。①GSE36001：利用校正后P＜0.05 篩選OS 患者的DEGs，其中logFC＞1為上調DEGs，反之為下調DEGs；②GSE36002 中利用校正后P＜0.05 篩選OS 甲基化DEGs，其中t＞2 為高甲基化DEGs，反之為低甲基化DEGs?；赩enny 平臺，將上調DEGs 與低甲基化DEGs 取交集，下調DEGs與高甲基化DEGs 取交集，再將兩交集取并集，得到OS 特異性甲基化DEGs 并對其進行可視化分析。

1.3 甲基化DEGs 的GO 及KEGG 富集分析

基于David 6.8 數據庫，以P≤0.05 為過濾條件，分別對高、低甲基化DEGs 集進行GO 和KEGG 分析，運用R 語言可視化分析前20 條富集條目。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

通過STRING 數據庫設定篩選閾值為0.4 獲得OS 特異性甲基化DEGs 的PPI 網絡，再將其數據導入Cytoscape 3.6 軟件，使用CytoHubba 插件對其進行拓撲分析，根據介數中心性、度值、緊密度、馬修斯相關系數篩選核心DEGs。

1.5 核心基因預后生存分析

利用R2 平臺，對核心DEGs 使用Kaplan-Meier法預估患者生存時間，并生成生存曲線，以P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OS 特異性甲基化DEGs 分析

OS 樣本包含3 433 個高甲基化區域和2 212 個低甲基化區域。在GSE36001 和GSE36002 中，將基因集下調DEGs 與高甲基化DEGs 取交集得到128 個下調的OS 高甲基化DEGs，基因集上調DEGs與低甲基化DEGs 取交集得到44 個上調的OS 低甲基化DEGs，將兩個交集取并集得到OS 特異性甲基化DEGs 172 個，并對172 個基因進行可視化。見圖1。

圖1 GSE36001 和GSE36002 中172 個特異性甲基化差異表達基因

2.2 OS 患者特異性甲基化DEGs 的GO 及KEGG 富集分析

GO 分析結果顯示，OS 高甲基化DEGs 主要參與表皮發育和皮膚細胞分化、體液免疫反應、角質形成與細胞分化等生物過程。OS 低甲基化DEGs 主要參與細胞分化、離子跨膜轉運調節、跨突觸信號傳導調節等生物過程。KEGG 結果顯示，OS 高甲基化DEGs包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子及其受體的相互作用、Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）、細胞色素P450 等通路；OS 低甲基化DEGs 包括Ca2+、MAPK、cAMP、癌癥中的蛋白聚糖等通路。見圖2～3。

圖2 骨肉瘤患者高甲基化基因GO 和KEGG 富集分析條形圖

圖3 骨肉瘤患者低甲基化基因GO 和KEGG 富集分析條形圖

2.3 PPI 網絡

利用172 個特異性甲基化DEGs 構建PPI 網絡，獲得8 個核心基因。見圖4。8 個核心基因參數見表1，其中RAC2 和PLEK 為下調高甲基化DEGs，其余為上調低甲基化DEGs。

表1 核心基因甲基化差異表達基因參數

圖4 核心甲基化差異表達基因蛋白質-蛋白質相互作用網絡

2.4 預后生存分析

ALOX5AP、HCK、LAPTM5、RAC2、LCP2、AIF1、TYROBP 和PLEK 高表達的OS 患者生存率高于低表達患者，差異有統計學意義（P=0.027、0.027、0.002、0.023、0.024、0.019、0.029、0.027）。見圖5～6。

圖6 LCP2、AIF1、TYROBP、PLEK 基因骨肉瘤患者的生存曲線

3 討論

在GEO 中，OS 樣本包含3 433 個高甲基化區域和2 212 個低甲基化區域，通過GO 和KEGG 分析揭示TLR、細胞色素P450、MAPK 通路富集較為明顯。TLR 是一種細胞膜結合受體，其參與了細胞炎癥反應過程[14]。研究表明，胰腺微生物組在啟動信號級聯反應中可能通過TLR4 激活胰腺腫瘤細胞促進炎癥因子白細胞介素1β 的產生而發揮重要作用[15]。而腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素1 等多種炎癥細胞因子參與了OS 進展[16]。此外，TLR9 可以識別細菌基因組和病毒DNA 中未甲基化的CpGDNA。漿細胞樣樹突狀細胞和B 細胞中TLR9 可以激活Thelper-1 型免疫應答和抗腫瘤活性。當通過招募髓樣分化因子MyD88激活的TLR9 與內體中配體結合后，可以誘導促炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素分泌[17]。Dhaini 等[18]發現，細胞色素P450CYP3A4/5 的高表達可能提示OS 的轉移和不良預后，表明其作為OS 靶標的潛力。此外，細胞色素P450 酶可以代謝類固醇、脂肪酸、藥物、毒素和致癌物[19]。Trujillo-Paolillo 等[20]發現，毗鄰肺轉移的OS中CYP1A2 過表達，提示CYP1A2 在OS轉移過程中重要作用，OS 及其轉移瘤標本中CYP3A4的表達低于正常骨組織，然而化療后，OS 標本中CYP3A4 表達升高，提示CYP3A4 在OS 中的調控作用。因此，CYP1A2 和CYP3A4 在化療藥物代謝中的作用可能與化療后的EFS 和治療反應有關。

MAPK 通路在OS 進展中具有重要作用。經β-異硫氰酸苯乙酯（β-phenethyl isothiocyanate，PEITC）治療后，OS 細胞MAPK 家族蛋白（ERK、P38、JNK）被激活，證明PEITC 通過誘導氧化應激反應使OS 細胞發生凋亡、自噬[21]。研究表明，特異性硫酸肝素蛋白聚糖和硫酸肝素生物合成酶的表達與OS 患者不良預后有關系[22]。此外，唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素15（sialic acid binding ig like lectin-15，Siglec-15）在OS鼠模型中過表達能促進腫瘤細胞生長、遷移和侵襲。當Siglec-15 表達被抑制時，雙特異性磷酸酶介導的p15/MAPK 和JNK/MAPK 表達的抑制減弱，表明Siglec-15通過抑制雙特異性磷酸酶介導的MAPK 途徑影響OS進展[23]。

本研究中，基于R2 平臺在無腫瘤轉移情況下，核心甲基化DEGs 高表達OS 患者的生存率高于低表達OS 患者，提示基因差異表達水平對OS 患者生存預后有影響。研究表明，在OS 細胞中HCK 表達異常上調，HCK 可能通過MEK/ERK 通路干預OS 進展，HCK 表達下調降低了p-MEK 和p-ERK 的蛋白水平，促進跨膜糖蛋白鈣黏素的積累，提示HCK 通過調節EMT 過程參與OS 進展[24]。因此，HCK 可能成為治療OS 潛在靶點?；騌AC2 在細胞存活、增殖及周期進展等生物過程中發揮關鍵作用[25-26]。Shao 等[27]對RAC2 表達和骨髓增生異常綜合征的研究顯示，與正常組比較，OS 組RAC2 表達更高，說明RAC2 與骨髓增生有關。LCP2 在T 細胞發育和激活中起關鍵作用[28]，而T 細胞的介導抑制腫瘤細胞繁殖[29]。生物信息學研究表明，LCP2 可能在腫瘤的發生和轉移中發揮作用，如結腸癌[30-31]和多形性膠質母細胞瘤[32]。AIF1 是一種炎癥因子，其通過激活p38-MAPK 通路可導致乳腺癌細胞中腫瘤壞死因子-α 表達上調，從而促進乳腺癌細胞遷移[33]。Lv 等[21]發現，PEITC 通過激活MAPKs 通路，誘導OS 細胞凋亡。這些研究提示AIF1 可能通過激活MAPKs 通路，促進OS 細胞凋亡。研究表明，TYROBP 參與了T 細胞、B 細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞的激活過程[34-35]。在生理條件下，小膠質細胞中表達的TREM2 受體與配體結合，再與TYROBP 相連接可誘導SYK 激酶的產生[36]，TYROBP 磷酸化可生成SYK 磷酸化底物，從而影響細胞生存[37]。有報道稱，TYROBP 參與了OS 免疫微環境相關的發病機制，其與各種免疫細胞表面受體結合，從而介導信號傳遞和細胞激活的生物過程。而富集在破骨細胞中TYROBP可以導致腫瘤細胞凋亡并影響腫瘤周圍的骨吸收[38]。

本研究基于生物信息學分析篩選得出8 個核心基因，作為OS 預后的重要靶標，在一定程度上為OS研究和治療提供新的方向和理論依據。