王娟弟,李 敏,劉 蕊,郭曉霞,李 欣,李冬華,馬 瀟*,郭朝暉

(1.甘肅省藥品檢驗研究院,甘肅蘭州 730070;2.國家藥品監督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

加味歸芪片收載于1992年出版的衛生部藥品標準《中藥成方制劑》第六冊(WS3-B-1118-92),具有補氣、養血之功效,用于氣血兩虧、氣虛體弱、肢體勞倦之癥[1],該制劑療效明確、適用人群廣、副作用小;其處方中的3味藥材當歸、黃芪、黨參均屬于甘肅省道地藥材。當歸是傘形科植物當歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根,具有補血活血等功效,主要分布在甘肅、四川及云南等地,甘肅岷縣被譽為“千年藥鄉”,其產當歸品質優良,又被稱為岷歸;其主要含有揮發油、有機酸、多糖和黃酮等成分[2-8]。2020年版《中國藥典》[9]以阿魏酸作為評價當歸藥材和飲片質量的指標性成分之一。黃芪是豆科植物蒙古黃芪[AstragalusmembranaceusBge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao]和膜莢黃芪[A.membranaceus(Fisch.) Bge.]的根,具有補氣固表、利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌的功效,主要分布在甘肅、內蒙古和山西等地;其主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類、生物堿類等成分[10-15]。2020年版《中國藥典》[9]以黃芪甲苷作為評價黃芪藥材和飲片質量的指標性成分之一。

加味歸芪片質量標準的內容簡單,僅有性狀、顯微鑒別、片劑通則項,不能有效控制產品質量。為此,該研究擬對加味歸芪片質量標準進行提升,提高產品質量,從而更加有效控制加味歸芪片的質量,確保加味歸芪片的療效,為臨床用藥提供質量保證。

1 儀器與材料

1.1 儀器高效液相色譜儀(日立,型號Chromaste);電子天平(瑞士梅特勒公司,型號ME204、MS205DU);旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司,型號Rotavapor R-300);離心機(艾本德公司,型號5810R);薄層色譜點樣儀(瑞士卡瑪公司,型號ATS4)。

1.2 試藥與樣品當歸(中國食品藥品檢定研究院,批號120927-201617);阿魏酸(中國食品藥品檢定研究院,批號110773-201614);黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院,批號120974-21813);甲醇、乙腈均為色譜級;水為屈臣氏水;其余試劑均為分析純。加味歸芪片(批號180501、181101、190101、190701、191201、191202、191203、191204、200101、200102、200103、200104)來源于佛仁制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 當歸成分的薄層色譜鑒別取本品適量,去包衣,粉碎,精密稱定粉末5 g,加乙醚20 mL,超聲處理10 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加乙醇1 mL溶解,作為供試品溶液。另取當歸陰性藥材5 g、當歸藥材(原料)0.5 g、當歸對照藥材0.5 g,同法制成當歸陰性對照溶液、當歸藥材(原料)和當歸對照藥材溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取上述3種溶液各10 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以環己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干。置紫外光燈(365 nm)下檢視,結果見圖1。

注:1～12為樣品,批號依次為180501、181101、190101、190701、191201、191202、191203、191204、200101、200102、200103、200104;13為當歸藥材(原料);14為當歸陰性樣品;15為當歸對照藥材。Note:1-12 are samples, with batch numbers 180501, 181101, 190101, 190701, 191201, 191202, 191203, 191204, 200101, 200102, 200103, and 200104 in sequence; 13 is Angelica sinensis medicinal material (raw material); 14 is a negative sample of Angelica sinensis; 15 is the reference medicinal material of Angelica sinensis.圖1 加味歸芪片中當歸對照藥材薄層鑒別Fig.1 Thin layer identification of Angelica sinensis reference medicinal material in Jiawei Guiqi tablets

取本品適量,去包衣,粉碎,精密稱定粉末5 g,加1%碳酸氫鈉溶液50 mL,超聲處理10 min,6 000 r/min離心5 min,取上清液用稀鹽酸調節pH至2～3;用乙醚振搖提取2次,每次20 mL,合并乙醚液,揮干,殘渣加甲醇1 mL溶解,搖勻,作為供試品溶液。另取當歸陰性藥材5 g、當歸藥材(原料)0.5 g,同法制成當歸陰性和當歸藥材(原料)對照溶液。另取阿魏酸對照品,加甲醇制成1 mg/mL溶液,作為對照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取上述3種溶液各10 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以環己烷-乙酸乙酯-二氯甲烷-甲酸(4∶1∶1∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,結果見圖2。

注:1～12為樣品,批號依次為180501、181101、190101、190701、191201、191202、191203、191204、200101、200102、200103、200104;13為當歸藥材(原料);14為當歸陰性樣品;15為阿魏酸對照品;16為當歸對照藥材。Note:1-12 are samples, with batch numbers 180501, 181101, 190101, 190701, 191201, 191202, 191203, 191204, 200101, 200102, 200103, and 200104 in sequence; 13 is Angelica sinensis medicinal material (raw material); 14 is a negative sample of Angelica sinensis; 15 is the reference substance for ferulic acid; 16 is the reference medicinal material of Angelica sinensis.圖2 加味歸芪片中阿魏酸對照品薄層鑒別Fig.2 Thin layer identification of ferulic acid reference substance in Jiawei Guiqi tablets

加味歸芪片樣品、當歸對照藥材以及阿魏酸對照品均有相應的斑點,斑點清晰,分離條件好,并且加味歸芪片當歸陰性無干擾,因此對當歸對照藥材和阿魏酸對照品進行定性鑒別。

2.2 黃芪成分的薄層色譜鑒別取本品適量,去包衣,粉碎,精密稱定粉末5 g,置錐形瓶中,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,放冷,過濾,收集濾液,蒸干,殘渣溶解于10 mL 10%(V/V)氨水溶液中,待溶解完全,將溶液轉移至分液漏斗中,用水飽和的正丁醇萃取3次(15、10、10 mL)。合并提取液,蒸干,殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,即得。取黃芪對照藥材1 g、黃芪藥材(原料)1 g、黃芪陰性樣品5 g,同法制備對照藥材和黃芪藥材(原料)溶液及陰性對照溶液。取黃芪甲苷對照品,加甲醇制成1 mg/mL溶液,即得對照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗,吸取上述溶液5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)的下層溶液作為展開劑,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇,105 ℃干燥之顯色,置紫外光(365 nm)下檢視,結果見圖3。

注:1～6為樣品,批號依次為180501、181101、190101、190701、191201、191202;7為黃芪甲苷對照品;8為黃芪對照藥材;9為黃芪藥材(原料);10為陰性對照;11～16為樣品,批號依次為191203、191204、200101、200102、200103、200104。Note:1-6 are samples, with batch numbers 180501, 181101, 190101, 190701, 191201, 191202 in sequence; 7 is the reference substance for astragaloside IV; 8 is the reference medicinal material of Astragalus membranaceus; 9 is Astragalus membranaceus medicinal material (raw material); 10 is a negative control; 11-16 are samples, with batch numbers 191203, 191204, 200101, 200102, 200103, and 200104 in sequence.圖3 加味歸芪片中黃芪甲苷對照品薄層鑒別Fig.3 Thin layer identification of astragaloside IV reference substance in Jiawei Guiqi tablets

加味歸芪片樣品與黃芪甲苷對照品有相應的斑點,斑點清晰,分離條件好,且黃芪陰性無干擾。加味歸芪片樣品與黃芪對照藥材有相應的斑點,斑點清晰,但黃芪陰性有干擾。因此對黃芪甲苷對照品進行定性鑒別。

2.3 阿魏酸含量測定

2.3.1色譜條件。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83)為流動相;檢測波長為316 nm;柱溫35 ℃。

2.3.2對照品溶液的制備。取阿魏酸對照品11.44 mg,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,加70%甲醇制成0.228 8 mg/mL的溶液,作為儲備液。

2.3.3供試品溶液的制備。取本品20片,除去包衣,研細(過三號篩),取約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,靜置,取上清液濾過,取續濾液,即得。

2.3.4方法學考察。

2.3.4.1線性曲線的繪制。精密量取對照品儲備液,分別制成2.265、4.530、6.795、9.060、18.121、22.651 μg/mL對照品溶液,以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制線性曲線,其線性方程為y=5E+07x-2 062.5(R2=0.999 9),表明阿魏酸在2.265～22.651 μg/mL線性關系良好。

2.3.4.2精密度、穩定性、重復性試驗。取“2.3.2”項下的對照品溶液,按“2.3.1”色譜條件,連續進樣6次,記錄峰面積并計算其含量,得出阿魏酸含量的RSD為 0.4%,表明測定儀器精密度良好。取同一供試品溶液(批號190701),按照“2.3.1”色譜條件,分別于0、4、8、12、16、24 h進行測定,記錄峰面積,計算得到阿魏酸含量的RSD為2.0%,說明供試品溶液在24 h內穩定。取同一批樣品(批號190701)粉末2 g,精密稱定,共稱取6份,按“2.3.3”方法制備供試品溶液,并按“2.3.1”色譜條件進樣測定,記錄各樣品的峰面積,計算得出阿魏酸含量的RSD為3.3%,表明該分析方法穩定,重復性良好。

2.3.4.3加樣回收試驗。取已知含量的樣品(批號190701)粉末約1 g,精密稱定,共稱取6份,置具塞錐形瓶中,分別加入阿魏酸對照品溶液(0.018 12 mg/mL)4.0 mL,按“2.3.3”方法制備供試品溶液,并按“2.3.1”色譜條件進樣測定,記錄峰面積,計算得到阿魏酸回收率在95.66%～99.75%,平均回收率為97.38%,RSD為1.93%(表1),表明提取和檢測方法準確可行。

表1 阿魏酸加樣回收率(n=6)

2.3.4.4不同儀器、不同品牌色譜柱考察。

(1)沃特斯液相色譜不同色譜柱比較。取樣品(批號190701)2 g,精密稱定,按“2.3.3”方法制備供試品溶液,按“2.3.1”色譜條件,以La Chrom C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱,進樣測定,測得阿魏酸的含量分別為32.8、33.1、32.7 μg/片。因此不同品牌的色譜柱對阿魏酸的含量影響不明顯。

(2)日立液相色譜不同色譜柱比較。取樣品(批號190701)2 g,精密稱定,按“2.3.3”方法制備供試品溶液,按“2.3.1”色譜條件,以La Chrom C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱,進樣測定,測得阿魏酸的含量分別為32.9、33.0、32.8 μg/片。因此不同品牌的色譜柱對阿魏酸的含量影響不明顯。

2.3.4.5當歸原料藥材考察。取當歸原料粉末2 g,精密稱定,按“2.3.3”方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液10 μL,按“2.3.1”色譜條件注入高效液相色譜儀進行測定,測得當歸原料藥中阿魏酸含量為0.67 mg/g,其轉移率為33.7%。

2.3.4.6提取時間的考察。取本品20片(批號191204),除去包衣,研細(過三號篩),取約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,分別采用加熱回流1、2、3 h時,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補足減失的重量,搖勻,靜置,取上清液濾過,取續濾液,即得。測得阿魏酸含量分別為33.72、34.05、32.76 μg/片,阿魏酸含量差異不明顯,因此為了考慮節省資源,選擇提取時間為1 h。

2.3.5樣品測定。分別取不同批號的加味歸芪片、當歸陰性粉末約2 g,精密稱定,按“2.3.3”方法制備供試品溶液,按“2.3.1”色譜條件進樣測定,具體結果見圖4～5。從圖4可以看出,加味歸芪片中阿魏酸含量為29.6～34.0 mg/片,其中有一批阿魏酸(批號181101)的含量偏離。

圖4 加味歸芪片中阿魏酸含量散點圖Fig.4 Scatter plot of ferulic acid content in Jiawei Guiqi tablets

圖5 加味歸芪片中阿魏酸高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography of ferulic acid in Jiawei Guiqi tablets

2.4 黃芪甲苷含量測定

2.4.1色譜條件。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);以乙腈-水(32∶68)為流動相;用蒸發光散射檢測器檢測。

2.4.2對照品溶液的制備。取黃芪甲苷對照品10.12 mg,精密稱定,置25 mL棕色量瓶中,加甲醇制成0.404 8 mg/mL的溶液,作為儲備液。

2.4.3供試品溶液的制備。取本品20片,除去包衣,研細(過三號篩),取約2 g,精密稱定,加甲醇50 mL,密塞,超聲處理30 min,放冷,再搖勻,濾過,洗濾紙數次,蒸干,殘渣加水20 mL溶解,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨試液洗滌2次,每次40 mL,棄去氨液,正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇溶解,并轉移至5 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.4.4方法學考察。

2.4.4.1線性曲線的繪制。精密量取對照品儲備液,分別制成70.65、141.30、211.95、282.60、353.25、423.90、494.55 μg/mL 的對照品溶液,以1g峰面積為縱坐標、1g濃度為橫坐標繪制線性曲線,其線性方程為y=1.782 7x+1.741 2(R2=0.999 8),表明黃芪甲苷在70.65～495.55 μg/mL線性關系良好。

2.4.4.2精密度、穩定性、重復性試驗。取“2.4.2”項下的對照品溶液,按“2.4.1”色譜條件連續進樣6次,測得峰面積,計算得出黃芪甲苷峰面積的RSD為0.1%,表明儀器精密度良好。精密吸取同一供試品溶液(批號190101),按“2.4.1”色譜條件分別于0、4、8、12、16、24 h進樣測定,記錄峰面積,計算得出黃芪甲苷峰面積的RSD為1.6%,表明該藥品在24 h內穩定。取同一批樣品(批號190101)粉末2 g,精密稱定,共稱取6份,按“2.4.3”方法制備供試品溶液,并按“2.4.1”色譜條件進樣測定,記錄各樣品的峰面積,計算得出黃芪甲苷峰面積的RSD為2.3%,表明方法重復性良好。

2.4.4.3加樣回收試驗。取已知含量的樣品(批號190101)粉末約1 g,精密稱定,共稱取6份,置具塞錐形瓶中,分別加入黃芪甲苷對照品溶液(1.248 181 mg/mL)1.0 mL,按“2.4.3”方法制備供試品溶液,按“2.4.1”色譜條件進樣測定,記錄峰面積,計算得到黃芪甲苷回收率在91.23%～97.74%,平均回收率為93.92%,RSD為2.59%(表2),表明提取和檢測方法準確可行。

表2 黃芪甲苷加標回收率(n=6)

2.4.4.4不同品牌色譜柱考察。取樣品粉末2 g(批號190101),精密稱定,按“2.4.3”方法制備供試品溶液,按“2.4.1”色譜條件,以La Chrom C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Xbridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)為色譜柱,進樣測定,測得阿魏酸含量分別為0.408、0.410、0.420 mg/片。因此不同品牌的色譜柱對黃芪甲苷含量影響不明顯。

2.4.4.5黃芪原料藥材考察。取黃芪原料2 g,精密稱定,按“2.4.3”方法制備供試品溶液,按“2.4.1”色譜條件進樣測定,測得黃芪原料藥中黃芪甲苷含量為0.917 mg/g,其轉移率為79.7%。

2.4.4.6提取方法的考察。

(1)提取方法一。取3批樣品(180501、190101、200104),分別取20片,除去包衣,研細(過三號篩),取約2 g,精密稱定,加甲醇50 mL,密塞,超聲處理30 min,放冷,再搖勻,濾過,洗濾紙數次,蒸干,殘渣加水20 mL溶解,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨試液洗滌2次,每次40 mL,棄去氨液,正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇溶解,并轉移至5 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得,測得3批樣品180501、190101、200104中黃芪甲苷含量分別為0.421、0.420、0.428 mg/片。

(2)提取方法二。取3批樣品(180501、190101、200104),分別取20片,除去包衣,研細(過三號篩),取約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液(取濃氨試液4 mL,加80%甲醇至100 mL,搖勻)50 mL,密塞,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用含4%濃氨試液的80%甲醇溶液補足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取續濾液25 mL,蒸干,殘渣用80%甲醇溶解,轉移至5 mL容量瓶中,加80%甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得,測得3批樣品180501、190101、200104中黃芪甲苷含量分別為0.121、0.130、0.122 mg/片。

通過比較提取方法一和提取方法二可知,采用提取方法一測得黃芪甲苷含量明顯高于提取方法二,因此該試驗選擇提取方法一。

2.4.5樣品測定。分別取不同批號的加味歸芪片、黃芪陰性粉末約2 g,精密稱定,按“2.4.3”方法制備供試品,按“2.4.1”色譜條件進樣測定,具體結果見圖6～7。從圖6可以看出,加味歸芪片中黃芪甲苷含量為0.383～0.449 mg/片,其中有一批黃芪甲苷(批號181101)的含量偏離。

圖6 加味歸芪片中黃芪甲苷含量散點圖Fig.6 Scatter plot of astragaloside IV content in Jiawei Guiqi tablets

圖7 加味歸芪片中黃芪甲苷對照品高效液相色譜圖Fig.7 High performance liquid chromatography of astragaloside IV reference substance in Jiawei Guiqi tablets

3 結論

加味歸芪片組方分別為當歸、黃芪、黨參,該試驗主要對該組方制劑中的當歸、黃芪兩味君臣藥進行了研究。采用薄層色譜法,在不同溫度不同濕度條件下考察了當歸和黃芪的薄層色譜條件,結果發現在不同條件下,當歸對照藥材和阿魏酸對照品以及黃芪甲苷對照品在各自薄層條件下斑點清晰,分離效果明顯,陰性均無干擾。因此該薄層色譜條件能很好地對加味歸芪片中當歸和黃芪進行定性鑒別。

加味歸芪片中當歸的含量考察采用阿魏酸指標成分,采用的高效液相色譜方法系統適應性符合要求,穩定性、精密度、重復性、回收率等方法學考察均能達到要求;采用不同儀器、不同品牌色譜柱等考察,系統適應性滿足試驗要求;同時考察不同提取時間對阿魏酸含量的影響,結果發現提取時間對阿魏酸含量影響不明顯,為了經濟又節省時間,因此選擇提取時間為1 h。

加味歸芪片中黃芪的含量考察采用黃芪甲苷指標成分,采用的高效液相色譜方法系統適應性符合要求,穩定性、精密度、重復性、回收率等方法學考察均能達到要求;考察不同品牌色譜柱,含量差異不明顯,系統適應性滿足試驗要求;考察不同提取方法對黃芪甲苷的影響,結果測得含量差異明顯,樣品采用甲醇提取之后,再用水飽和的正丁醇溶液和氨試液分別萃取,得到的黃芪甲苷含量較高,因此選擇該提取方法。

該研究建立的方法簡單、方便、可行性和重復性良好,為加味歸芪片質量標準提供技術支撐,同時更加有效控制加味歸芪片的質量,確保了加味歸芪片的療效,為臨床用藥提供質量保證。