不同懸鉤子屬植物ITS序列的多態性分析

高 柱,郭芙蓉,楊靜遠,汪 琪

(1.安徽國科檢測科技有限公司,安徽合肥 230041;2.安徽農業大學生命科學學院,安徽合肥 230036)

懸鉤子屬(Rubus)為薔薇科(Rosaceae)薔薇亞科(Rosoideae)中的一個屬,落葉稀常綠灌木、半灌木或匍匐草本,多年生宿根植物。據統計,該屬植物目前已發現700余種,分布于全世界,主要產地在北半球溫帶,少數分布到熱帶和南半球,我國有204種104變種[1]。懸鉤子植物在我國西南地區,特別是四川、廣東、廣西、福建及云南等[2]地區有較多分布,占目前全國總懸鉤子屬植物種數的60%以上。多數懸鉤子屬植物的果實、種子、根及葉可入藥,具有驅寒祛濕、止血止痛、清熱解毒、活血化瘀及固腎澀精等功效[3];有些種類的果實多漿,味甜酸,可供食用[4]。

懸鉤子屬植物種類繁多[5],植物分類學家對其分類進行了大量研究工作,但不同學者在懸鉤子屬植物的范圍劃分和亞屬的分類方面有不同見解。1979年劉金[6]將懸鉤子屬植物分為實心莓亞屬、刺毛莓亞屬、空心莓亞屬、大花莓亞屬和軟枝莓亞屬5個亞屬。俞德浚等[7-9]以懸鉤子屬植物主要器官性狀特征及細胞學資料為依據,將已發現的194種懸鉤子屬植物分為8組24亞組,其中,空心莓組(Sect.Idaeobatus)和木莓組(Sect.Malachobatu)植物包含種類較多。空心莓組(Sect.Idaeobatus)植物又分為11個亞組,共83種50個變種;木莓組(Sect.Malachobatu)植物又分為13個亞組,85種35個變種。亞組之間的分類主要依據該植物的葉型、花序及葉片性狀等生物學特征[10]。近年來,我國植物學工作者在各國家和地區又陸續發現許多新種,如腺果懸鉤子(R.glandulosocarpus)、武夷懸鉤子(R.jiangxiensis)、鉛山懸鉤子(R.yanshanensis)、少花懸鉤子(R.spananthus)和九仙莓(R.yanyunii),補充并完善了我國懸鉤子屬植物的分類系統[11-14]。

懸鉤子屬植物因其種類繁多,變異性大,類型復雜,而且存在無融合生殖現象,并伴有多倍體出現,僅依據外部形態特征進行分類比較困難。筆者利用DNA條形碼技術,探索懸鉤子屬植物ITS序列的特征,揭示其系統進化關系,為懸鉤子屬植物的分類鑒定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料用于ITS分析的13份懸鉤子屬核心種質資源分別采集自安徽、貴州、浙江、廣西、江西和湖南,定植于安徽農業大學國家高新技術農業園,種質信息見表1。

表1 不同懸鉤子屬種質資源所屬種類與產地

1.2 懸鉤子屬植物DNA的提取研缽、槍頭、離心管等器材均經高溫滅菌處理,利用植物DNA提取試劑盒(艾德萊生物公司,北京)提取懸鉤子屬植物的基因組DNA,具體操作參照試劑盒說明書。檢測合成DNA樣品于-20 ℃保存備用。

1.3 懸鉤子屬植物ITS序列的克隆克隆ITS序列所用的PCR引物分別為ITS-F:GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG、ITS-R:CTTTTCCTCCGCTTATTGATATG,引物委托公司合成。PCR反應體系參照2×TaqMaster Mix說明書(擎科生物科技有限公司,南京)。反應程序為98 ℃預變性3 min,變性10 s;55 ℃復性10 s;72 ℃延伸10 s,35個循環;72 ℃延伸2 min。膠回收采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒(寶生物工程有限公司,大連),膠回收產物委托公司測序。

1.4 懸鉤子屬植物ITS序列的生物信息學分析采用基于隱馬爾科夫模型的注釋方法(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/),去除測序序列的5.8S和ITS1序列,獲得ITS2間隔區序列。利用NCBI網站BLAST工具,對ITS2序列進行比對檢驗。

利用DNAMAN軟件對5.8S、ITS1和ITS2序列進行比對;利用BioEdit 7.0軟件對ITS2序列單個堿基進行分析;利用MEGA7軟件對ITS2序列進行分析,利用鄰接法(Neighbor Jioning,NJ)構建系統發育樹。構建ITS2系統進化樹的近緣植物的相關序列見表2。

表2 薔薇科近緣植物的ITS2序列

2 結果與分析

2.1 懸鉤子屬植物基因組DNA的ITS序列克隆及鑒定選取不同懸鉤子屬種質資源13份,開展基因組DNA的ITS克隆和分析。以不同供試材料DNA為模板,進行了ITS序列的PCR擴增,將克隆的產物進行瓊脂糖凝膠回收檢測,結果見圖1。由圖1可知,核心種質資源均獲得單一的PCR條帶,條帶大小約500 bp。

注:1～13.A9、A29、S、GH14、JF9、HH2、GB3、TW1、GA1、W5、B1-1、B2-1、B3-1。圖1 13份懸鉤子屬種質資源ITS序列的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ITS sequences of thirteen germplasm resources in the genus Rubus

對供試材料PCR產物進行純化回收,對測序結果進行5.8S、ITS1和ITS2序列分析(表3)。結果顯示,13份懸鉤子屬種質資源ITS區域的長度在462～464 bp。ITS1的序列長度在208～210 bp,GC含量為55.29%～58.17%;ITS2的序列長度在254～255 bp,GC含量為53.73%～55.12%;13份懸鉤子屬種質資源的5.8S序列相對保守,長度均為164 bp,GC含量為54.27%或54.88%。

表3 13份懸鉤子屬種質資源ITS序列的長度及GC含量

2.2 懸鉤子屬植物5.8S序列用DNAMAN軟件對ITS序列的5.8S區域進行分析,結果表明,懸鉤子屬植物的5.8S序列是高度保守的一個變異位點(124位的堿基A變成G)。其中,A9、A29、W5、GH14、JF9、HH2的5.8S區域序列一致為TAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGA-TGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAG-AATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCC-AAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACAC;B1-1、B2-1、B3-1、S、GB3、TW1、GA1的序列一致為TAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAG-AACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC-CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAG-CCATTAGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACAC。

2.3 懸鉤子屬植物ITS2序列利用BioEdit 7.0和DNAMAN軟件對懸鉤子屬植物的ITS2序列進行比對和差異分析(圖2)。結果顯示,13份懸鉤子屬種質資源的ITS2序列變異較大,存在堿基缺失的現象。其中JF9、GB3和TW1在+14 bp處存在1個堿基缺失,B1-1、B2-1和B3-1在+86 bp處存在1個堿基缺失。另外,除了A29、B1-1、S和HH2之外,其余種質資源在+123 bp處均存在1個堿基缺失。ITS2含有223個保守位點,32個信息位點,其中變異位點18個,單個核苷酸差異位點14個。

圖2 13份懸鉤子屬種質資源ITS2序列比對Fig.2 Comparison of ITS2 sequences among thirteen germplasm resources in Rubus

2.4 懸鉤子屬植物ITS2序列系統發育用MEGA7對13份懸鉤子屬種質資源的ITS2序列進行Kimura 2-parameter遺傳距離分析。并利用相關植物的ITS2序列作為內參,構建NJ系統發育進化樹。由圖3可知,供試的懸鉤子屬植物與草莓親緣關系較近(70%的自展支持率),與蘋果、梨和擬南芥分屬不同的進化支。不同懸鉤子植物可以分為4個亞簇。其中,簇Ⅰ由空心莓組的掌葉覆盆子A9、A29 和甜葉懸鉤子GH14 3個種質資源組成,簇Ⅱ由空心莓組的山莓HH2、JF9和W5 3個種質資源組成,簇Ⅲ由懸鉤子組的歐洲木莓B1-1、B2-1和B3-1 3個種質資源組成,簇Ⅳ由空心莓組的插田泡GA1、S、GB3和TW1 4個種質資源組成,分別獲得87%、85%、96%、58%的自展支持率。

圖3 基于ITS2序列構建的懸鉤子屬植物及常見植物的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of plants in Rubus and common plants based on ITS2 sequences

通過對4種標準外緣序列進行比對,發現不同懸鉤子植物ITS2序列在16～18和181～183位點上存在堿基差異,其他位置序列相對保守。由圖4可知,掌葉覆盆子、山莓、歐洲木莓和插田泡的16～18位堿基分別為AAC、AAT、AAA和AAC,其181～183位堿基分別為CGA、CGA、CAA和TGA。因此,不同懸鉤子ITS序列的16～18位、181～183堿基可作為懸鉤子屬植物分類的候選差異位點。由進化關系可知,GH14與掌葉覆盆子為同緣植物,在16～18位點上與掌葉覆盆子一致,但在181～183位點上由掌葉覆盆子的CGA變成了CGG,推測GH14可能是掌葉覆盆子與另一種懸鉤子屬植物的雜交或變異后代。遵循相同的判斷依據,A29在16～18上與掌葉覆盆子一致,在124～126位點上與掌葉覆盆子不一致,而與HH2一樣,HH2為山莓,推測A29可能為掌葉覆盆子與山莓的雜交后代。

圖4 懸鉤子屬植物ITS2區域的物種鑒定Fig.4 Identification of species in the ITS2 region of plants in the Rubus

3 討論

分子標記技術分為很多種,如RAPD標記、SCAR標記、DNA序列分析、特殊基因引物的PCR等技術,每種技術的用途不同。DNA分子標記技術與形態學標記、細胞學標記和蛋白質標記等傳統的標記技術相比,具有其獨特性和優越性,因為它不會受到季節、環境等條件的限制,在植物發育的不同時期,均可便捷地獲得DNA樣本[15]。另外,分子標記技術能夠鑒別出目標DNA的基因型是否為雜交,也可為任何植物提供較為完整的遺傳信息[16]。因此,DNA分子標記技術在懸鉤子屬植物種間種內鑒定中具有較廣的應用前景,可提高懸鉤子品種選育的效率。

ITS序列共包含3個部分,分別是ITS1、5.8S和ITS2,其中5.8S序列保守,ITS2應用最為廣泛,特別適用于植物種屬之間的系統發育分析。Chen等[17]對6 000余份樣本進行測序分析,指出序列中ITS2的分辨率高達92.7%;若以屬為基礎,ITS2的分辨率甚至可達到99.8%。我國傳統中藥材由于長期貯藏引起材料中DNA部分降解,ITS2具有較高的PCR擴增和測序效率,性能穩定,廣泛應用于多個科屬植物及藥材的鑒定中[18-19]。例如,以ITS2為基礎,針對藥用植物DNA條形碼鑒定的方法也被2010版和2015版的《中國藥典》納入[20]。對于藥用植物中,利用ITS分析可應用于藥材真偽品的鑒定上,構建藥材的DNA指紋圖譜[21]。例如,用來自全國26個不同地方的牛蒡和4個偽品為材料,ITS序列可準確將牛蒡和偽品區別開[22]。

懸鉤子屬植物資源豐富,進化歷程相對復雜,在進化中經歷了廣泛的雜交[23]、多倍化[24]和基因漸滲[25]等。因此,懸鉤子屬植物種間區分和進化關系亟待深入研究。筆者在13份懸鉤子屬種質資源基因組DNA提取的基礎上,開展了其ITS序列克隆、測序和鑒定。研究發現,不同懸鉤子屬植物5.8S區域的序列相對保守,僅有一個兼并堿基(14位A變為G)差異。不同懸鉤子屬種質資源的ITS2序列差異較大,具有區別不同品系的潛在優勢。NJ進化樹分析表明,13份懸鉤子屬種質資源與同為薔薇科的草莓親緣關系較近,分為掌葉覆盆子組、山莓組、歐洲木莓組和插田泡組4個亞簇。針對不同亞族間ITS2序列差異堿基,挖掘到ITS2序列在16～18和181～183位點存在種間差異,可作為候選位點區分不同亞族的品系。基于以上特點,該研究鑒定的ITS2序列作為屬中種間的物種鑒別是可行的。該研究的供試種質資源包括懸鉤子屬栽培品種及課題組收集的地方種質資源,對其ITS序列進行了克隆和分析,為今后研究該屬植物的遺傳多樣性和系統發育奠定了基礎。