云南省部分地區豬感染BVDV流行病學調查

夏九鮮,鄭旺華,王 磊,亐開興,尹革芬,畢峻龍*

(1.云南農業大學,云南昆明 650201;2.昆明市西山區動物防疫檢疫服務中心,云南昆明 650100;3.云南省普文公路動物防疫監督檢查站,云南景洪 666100;4.楚雄師范學院,云南楚雄 675000)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬,與豬瘟病毒(classical swine fever virus,CFSV)等病毒存在一定的同源性,且具有結構的相關性和抗原的相關性[1]。依據豬體免疫攻毒、瓊脂擴散、中和試驗以及免疫熒光試驗結果可知,牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒之間有較強的免疫學關系,2種病毒可溶性抗原相同的概率非常高[2]。由于BVDV感染豬后出現的臨床癥狀與非典型性豬瘟的癥狀極為相似,加之臨床上豬瘟病毒感染出現典型癥狀的概率較小,在檢測豬瘟病毒的過程中時常將BVDV感染誤判為豬瘟病毒感染[3-4]。豬被BVDV感染后,體內會形成與豬瘟病毒交叉的中和抗體,導致血清學診斷結果出現錯誤,從而會影響對BVDV的有效診斷和及時控制;同時,豬感染BVDV后成為一種潛在的傳染源,能傳染周邊的牛和羊,從而造成嚴重的經濟損失[5-6]。BVDV在多種動物之間相互傳播還可能會引起該病毒的不斷循環和漂移,從而威脅人類健康[7]。此外,豬體內BVDV抗體能夠抑制豬瘟病毒,豬感染BVDV后會對豬瘟疫苗的免疫造成影響,導致豬瘟疫苗的效果變差,成為豬瘟防控工作中的不利因素。許多持續性感染處于免疫耐受狀態,豬體內不一定產生抗體,處于長期帶毒、排毒狀態,從而造成BVDV的擴散和傳播[3,7]。前期筆者所在科研團隊已完成云南省一些地區牛感染BVDV的流行病學調查和毒株分離[8-9],但對豬感染BVDV的流行病學調查尚未開展。筆者利用RT-PCR檢測方法對云南省部分地區豬群開展BVDV流行病學調查,以期為云南省豬瘟的防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品來源。自2020年云南省部分地區不同規模養殖場各生長階段豬群采集211份糞便樣品,其中108份來自散養戶,103份來自規模豬場。各生長階段豬群糞便樣品詳見表1。

表1 不同規模豬場各生長階段豬糞便樣品

1.1.2引物合成。用于擴增BVDV的特異性引物由云南農業大學傳染病實驗室設計并提供,由昆明碩擎生物科技有限公司合成,TYF1為5′-GAGTACRGGGTAGTCGTCA-3′,TYR1為5′-TCCATGTGCCATGTACAGCAGA-3′,產物預期擴增片段大小220 bp。

1.2 方法

1.2.1樣品處理。將采集糞樣浸入0.9%生理鹽水中,用力搖晃使糞便與生理鹽水混合,于4 ℃下過夜后將液體轉移到新的無RNAase離心管中;4 ℃ 3 000 r/min下離心10 min,將上清液吸到新的無RNAase離心管中;去除糞便殘渣,用于核酸提取。

1.2.2RNA提取。于2 mL離心管中加入300 μL處理好的糞便樣品,加入800 μL RNAiso Plus(TRIzol),上下反復顛倒,使RNAiso Plus(TRIzol)與樣品混勻,4 ℃下靜置10 min;10 min后再加入160 μL氯仿溶液,上下反復顛倒15 s使兩相徹底混勻,4 ℃靜置10 min,12 000 r/min離心15 min;小心吸取上層無色溶液約500 μL置于新的1.5 mL無RNAase離心管中,加入等量異丙醇,4 ℃靜置10 min,12 000 r/min離心10 min,使RNA沉淀于離心管底部;小心倒去上清液,向離心管內加入1 mL 75%乙醇清洗,7 500 r/min離心5 min;倒去上清液,輕甩后用吸水紙吸干離心管壁的液體,每管加入20 μL DEPC水溶解RNA,瞬時離心,取5 μL RNA加樣到1.5%瓊脂糖凝膠(含0.2% EB)孔中,150 V電泳15 min,在凝膠成像系統上觀察提取RNA的完整性,并使用核酸定量儀定量RNA濃度。

1.2.3RNA反轉錄。反轉錄體系2×ES Reaction Mix(含10×RT Buffer,dNTPs) 5.0 μL;EasyScriptTM RT/RI Emzyme Mix(含RNase Inhibitor,反轉錄酶)0.5 μL;下游引物1.0 μL;模板RNA 3.5 μL;總反應體系10.0 μL。反轉錄程序:42 ℃ 30 min;85 ℃ 5 min。

1.2.4BVDV檢測。以反轉錄cDNA為模板,進行PCR擴增。PCR反應體系(25.0 μL)如下:2×TransHiFi Ⅱ 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1.0 μL。PCR擴增程序如下:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環35次;72 ℃ 5 min;于4 ℃下暫存。取10 μL PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠(含0.2% EB)電泳15 min后,置于凝膠成像系統下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 BVDV檢測通過BVDV特異性引物進行PCR擴增,對211份糞便樣品進行檢測和鑒定,所獲PCR產物電泳結果與預期目的片段大小(220 bp)相符,確定部分糞便樣品BVDV檢測呈陽性(圖1),其中24份樣品BVDV檢測呈陽性,陽性率為11.37%(24/211)。

注:1.陰性對照;2～6.部分樣品BVDV電泳鑒定結果;M.DNA Marker 1 000。Note:1.Negative control;2-6.BVDV electrophoresis identification of partial samples;M.DNA Marker 1 000.圖1 BVDV核酸檢測電泳結果Fig.1 The electrophoresis results of BVDV detection

2.2 不同規模豬場BVDV感染情況由表2可知,從散養戶采集108份糞便樣品,從規模豬場采集103份糞便樣品。通過對PCR產物進行鑒定與統計發現,散養戶豬糞便感染BVDV的陽性率為16.67%(18/108);規模豬場豬糞便感染BVDV的陽性率為5.83%(6/103),表明BVDV感染在豬場普遍存在。

表2 不同規模豬場的BVDV感染情況

2.3 不同生長階段豬BVDV感染情況由表3可知,66份哺乳仔豬糞便樣品中檢出陽性樣品5份,陽性率為7.58%(5/66);72份斷奶仔豬糞便樣品中檢出陽性樣品15份,陽性率為20.83%(15/72);34份育肥豬糞便樣品中檢出陽性樣品4份,陽性率為11.76%(4/34);39份種母豬糞便樣品中未檢出陽性樣品,陽性率為0(0/39)。由此可見,不同生長階段豬感染BVDV的情況不一樣,種母豬樣品未檢出BVDV陽性,這可能是由于樣品數量偏少所致。

表3 不同生長階段豬群的BVDV感染情況

3 討論

BVDV感染在牛群中極為普遍[10],并能通過糞便排泄向外排毒,成為持續的傳染源,從而感染多種家畜[11-14]。王新平等[12-13]通過雙夾心ELISA方法檢測出BVDV在牛、羊、鹿群中的感染率分別為16.5%～89.0%、14.6%～83.3%和19.6%～44.4%,后來從內蒙古哲盟疑似豬瘟病料中首次檢出BVDV。

從不同養殖規模來看,散養戶送檢樣品中BVDV陽性檢出率高于規模化養殖場,很可能是由于散養戶生物安全意識淡薄,養殖過程中存在多種動物混養;同時,該病感染后很少出現明顯的臨床癥狀,帶毒豬作為傳染源難以被發現并淘汰,導致該病的持續傳播[14]。該研究首次對云南省豬感染BVDV進行流行病學調查,發現散養戶與規模豬場的BVDV陽性率分別為16.67%和5.83%,與孫泉云等[11]對我國豬源BVDV的研究報道相一致,在豬舍條件簡陋、生物安全性低、防疫理念差的散養戶豬群中BVDV感染情況最嚴重,因而我國廣大農村養豬業者應該引起足夠重視,并減少多種牲畜的混喂混養。

從不同生長階段的豬糞便樣品檢測結果來看,不同生長階段的豬感染BVDV的程度不一樣。聶兆晶[15]對山東省BVDV流行情況的調查發現母豬和仔豬血清中BVDV抗體陽性率分別為45.3%和32.5%,豬場陽性率達88.5%(23/26);母豬和斷奶仔豬中BVDV的陽性率遠高于其他日齡的豬。該研究中哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬及種母豬BVDV的陽性率分別為7.58%、20.83%、11.76%和0,其中斷奶仔豬陽性率較高,而檢測的種母豬未感染BVDV。戴愛玲等[16]對福建龍巖規模化豬場豬感染BVDV流行情況進行調查時發現BVDV感染率為28.6%,豬場BVDV陽性率高達94.4%,種豬豬瘟免疫應注意防范BVDV污染。此外,豬被BVDV感染后,體內會形成與豬瘟病毒交叉的中和抗體,導致血清學診斷結果出現錯誤,最終會影響對BVDV的有效診斷與及時控制[5];同時,豬感染BVDV后生產力大大降低,并成為一種潛在的傳染源,能傳染附近的牛群和羊群,從而造成嚴重的經濟損失[6]。因此,在檢驗檢測中應考慮BVDV與CSFV混合感染情況,減少誤診誤判。

在肉牛、牦牛養殖中,BVDV感染普遍存在。高雙娣等[17]研究發現西北和西南五省(區)黃牛的BVDV陽性率為46.15%,牦牛的BVDV陽性率為30.08%;孟慶森等[18]從不同省份采集451份樣品,血清的BVDV中和抗體陽性率為25.6%～91.1%,總陽性率為78.5%;研究表明,青海、西藏牦牛群BVDV的陽性率在27%以上[19-20]。筆者前期研究表明云南省4州(市)10縣(市)BVDV的抗體陽性率為0～60%,整體抗體陽性率為16.45%,各地區之間陽性率差異較大[9],但對云南省豬感染BVDV的流行病學調查尚屬首次,今后應當結合多種家畜腹瀉發生率來綜合考慮BVDV防控。近年來,我國在豬瘟防控上收效甚微,很可能是由于BVDV流行所致。豬群因免疫被BVDV污染的豬瘟疫苗而感染,感染BVDV后又會影響豬瘟疫苗的免疫效果,因此在豬瘟防控過程中豬瘟疫苗BVDV的污染狀況和豬群感染BVDV情況不容忽視,今后應當加強BVDV和CSFV的相關基礎研究。在流行病學調查中充分結合多種家畜混養區的BVDV流行和混合感染情況,做出流調的全面分析與防控[7,18,21-22],為今后云南省豬群BVDV和豬瘟的防控奠定理論依據。