豬MMP9基因的多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

劉林清,李慶崗,蘇世廣,周 梅,張 威,王重龍

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230031)

MMPs作為一類(lèi)活性依賴(lài)于鋅離子的肽鏈內(nèi)切酶,在卵泡和子宮外組織的動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。MMPs的合成與分泌與卵泡破裂卵子排出的生化反應(yīng)有關(guān),包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、孕酮、前列腺素和蛋白水解酶等。并且蛋白水解酶可以通過(guò)降解卵泡壁結(jié)締組織,從而促進(jìn)排卵[1]。增強(qiáng)MMP的活性可加速降解卵泡細(xì)胞外基質(zhì),抑制MMP活性后,排卵過(guò)程某種程度上受到抑制[2-4]。MMP9作為MMPs的家族成員之一,參與降解IV型膠原底物,IV型膠原是基膜的主要成分且其他基膜元件也可通過(guò)IV型膠原相結(jié)合,從而在繁殖組織的發(fā)育和重塑過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),MMP9及其抑制因子TIMP2參與胚泡對(duì)子宮內(nèi)膜的侵入[7]。Robker等[8]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠內(nèi)源LH峰或hCG處理后,MMP9基因表達(dá)量上升。這些研究結(jié)果進(jìn)一步暗示了MMP9 基因在卵泡的發(fā)育和排卵過(guò)程中發(fā)揮作用。

為此,筆者建立了MMP9 基因的PCR-SmaI-RFLP分型技術(shù),并在淮豬新品系Ⅱ豬群中進(jìn)行多態(tài)性分型,檢測(cè)該位點(diǎn)的多態(tài)性及其與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,以期為提高豬產(chǎn)仔數(shù)提供一個(gè)有用的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料試驗(yàn)地點(diǎn)在安徽省科鑫養(yǎng)豬育種有限公司;于2014年7月采集85頭淮豬新品系Ⅱ系豬的耳組織,放置于75%乙醇的離心管中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1DNA提取。采用苯酚-氯仿抽提法,TE溶解,-20 ℃冷凍保存。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)MMP9基因DNA序列,應(yīng)用Premier 5.0軟件在多態(tài)位點(diǎn)(第10內(nèi)含子)兩側(cè),設(shè)計(jì)一對(duì)引物,突變位點(diǎn)可用限制性內(nèi)切酶SmaI識(shí)別,引物由上海生工生物公司合成。引物信息:MMP9基因的上游引物5′-TCATGTCCCCAGGAAGTAC -3′,下游引物5′-GGCCCAACTTATCCAGAC -3′,片段長(zhǎng)度為559 bp,退火溫度為55.6 ℃。

1.2.3PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中PCR 2×Taqmix 12.5 μL,10 mmol/μL的引物各0.5 μL,DNA模板1.0 μL(DNA約100 ng),加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為第1步95 ℃變性5 min;第2步95 ℃變性45 s;第3步55.6 ℃復(fù)性40 s;第4步72 ℃延伸35 s;重復(fù)第2～4步35個(gè)循環(huán),之后72 ℃延伸10 min,最后降溫至4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳,核酸染料染色,凝膠成像系統(tǒng)中觀察,可見(jiàn)到片段大小為559 bp的清晰條帶。

1.2.4限制性內(nèi)切酶酶切(RFLP)。MMP9基因的PCR產(chǎn)物用SmaI內(nèi)切酶酶切,反應(yīng)體系:10×Buffer 1.0 μL,SmaI酶0.3 μL(10 U/μL),加PCR產(chǎn)物至10 μL;37 ℃反應(yīng)8～12 h;酶切產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳,核酸染料染色,凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1統(tǒng)計(jì)分析的軟件。采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件(SAS Institute Inc,Version 8 Edition)的GLM程序進(jìn)行方差分析,并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.3.2基因效應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析模型。依據(jù)Liu[9]的方法建立的單標(biāo)記回歸統(tǒng)計(jì)模型,除豬個(gè)體為隨機(jī)效應(yīng)外,其他因素均為固定效應(yīng)。所采用模型Y=平均值+基因型+胎次效應(yīng)+殘差,其中Y為性狀表型值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬MMP9基因的多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為559 bp,經(jīng)SmaI酶切后產(chǎn)生3種基因型(圖1)。當(dāng)多態(tài)位點(diǎn)為CC基因型時(shí),則造成了SmaI酶切位點(diǎn),PCR產(chǎn)物經(jīng)SmaI消化后產(chǎn)生2個(gè)片段(464 bp+95 bp),記為等位基因C;當(dāng)多態(tài)位點(diǎn)為T(mén)T基因型時(shí),則酶切位點(diǎn)消失,PCR產(chǎn)物經(jīng)SmaI消化后產(chǎn)生1個(gè)片段(559 bp),記作等位基因T。

圖1 豬MMP9基因SmaI酶切分型結(jié)果Fig.1 SmaI enzyme digestion results of porcine MMP9 gene

2.2 豬MMP9基因在淮豬新品系II系豬群體中的基因型和等位基因的頻率分布MMP9基因SmaI酶切位點(diǎn)在所檢測(cè)的豬群中,基因型TT、TC、CC頻率分別為0.05、0.39、0.56,C等位基因占優(yōu)勢(shì)(0.76),T等位基因頻率為0.24。

2.3 豬MMP9基因SmaI多態(tài)位點(diǎn)基因型與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用基因效應(yīng)統(tǒng)計(jì)分析模型[9],采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件的GLM程序在淮豬新品系II系豬群體中進(jìn)行豬MMP9基因PCR-SmaI-RFLP多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析。

在淮豬新品系II系豬群體中,所有胎次產(chǎn)仔數(shù)均呈TC>CC>TT的趨勢(shì)。其中,TC型個(gè)體的所有胎次產(chǎn)仔數(shù)顯著高于CC型個(gè)體0.776頭(P<0.05)(表1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,TC型和CC型母豬具有較高的產(chǎn)仔數(shù),C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。

表1 MMP9基因PCR-SmaI-RFLP基因型與淮豬新品系II產(chǎn)仔數(shù)性狀的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

淮豬新品系Ⅱ是以安徽省優(yōu)良地方品種淮豬為母本,以國(guó)外優(yōu)質(zhì)瘦肉型品種長(zhǎng)白豬、大白豬為父本,經(jīng)過(guò)雜交育種組建基礎(chǔ)群,然后運(yùn)用標(biāo)記輔助選擇BLUP估計(jì)育種值進(jìn)行群體繼代選育。MMPs作為一類(lèi)活性依賴(lài)于鋅離子的肽鏈內(nèi)切酶,在卵泡和子宮外組織的動(dòng)態(tài)變化中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。MMP9作為MMPs的家族成員之一,參與降解IV型膠原底物,在繁殖組織的發(fā)育和重塑過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。且研究發(fā)現(xiàn),在小鼠內(nèi)源LH峰或hCG處理后,MMP9基因表達(dá)量上升[8,10]。此外,Dubois等[11]研究發(fā)現(xiàn),MMP9基因敲除小鼠后,配種率下降,頭胎和經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)仔數(shù)均低于正常小鼠。這進(jìn)一步暗示了MMP9 基因在卵泡的發(fā)育和排卵過(guò)程中發(fā)揮作用。

基因敲除試驗(yàn)表明,MMP9基因敲除小鼠配種率下降,頭胎和經(jīng)產(chǎn)窩產(chǎn)鼠數(shù)均低于正常小鼠[12]。結(jié)合MMP9在胚胎著床中的重要作用,推斷該基因?qū)ωi產(chǎn)仔數(shù)有重要影響。

該研究發(fā)現(xiàn),MMP9基因SmaI酶切位點(diǎn)在淮豬新品系II系豬群體中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C等位基因占優(yōu)勢(shì),且在所有胎次產(chǎn)仔數(shù)呈TC>CC>TT的趨勢(shì)。其中,TC型個(gè)體的所有胎次產(chǎn)仔數(shù)顯著高于CC型個(gè)體0.776頭(P<0.05),表明TC型和CC型母豬具有較高的產(chǎn)仔數(shù),C等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因,因此在今后選育中可適當(dāng)提高C等位基因的頻率。