基于網絡藥理學預測金匱腎氣丸治療肝衰竭的作用機制

張煒崧,王 漢,孫 鵬,桑子淇,劉玉茹,葉 桐,劉鐵軍

(1.長春中醫藥大學 中醫學院,吉林 長春 130117;2.中國中醫科學院 中藥研究所,北京 100700;3.長春中醫藥大學附屬醫院,吉林 長春 130021)

肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損害,導致合成、解毒、代謝和生物轉化功能嚴重障礙或失代償,出現以黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水等為主要表現的一組臨床癥候群[1]。肝衰竭病因其多樣性,臨床表現復雜,病死率極高,因此臨床診治難度大[2]。近10年來,國內關于重型肝炎、肝衰竭的中醫證候規律、中西醫結合治療的研究日趨增多,中西醫結合治療能夠提高患者的生存率,在改善癥狀等方面也有較好的療效[3]。

肝衰竭屬于中醫“急黃”“瘟黃”等范疇,《諸病源候論·黃病諸侯》中記載:“脾胃有熱,谷氣郁蒸,因為熱毒所加,故卒然發黃,心滿氣喘,命在頃刻,故云急黃也。”急黃(或瘟黃)在發病過程中可出現血證、鼓脹、肝厥等,病機上多屬于“正虛邪實”,其基本病機集中在濕、熱、毒、瘀、虛等幾方面[3]。金匱腎氣丸記載于張仲景的《金匱要略》,其方由熟地黃、附子、桂枝、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、澤瀉諸藥組成,主要功效為溫補腎陽、化氣行水、滋陰化瘀。臨床實踐表明,金匱腎氣丸不僅能減少腹水,還可降低黃疸、提升血中白蛋白濃度、改善凝血功能,廣泛應用于治療肝衰竭[4-10]。鑒于中藥多成分、多靶點等原因,目前金匱腎氣丸治療肝衰竭的藥效物質基礎及作用機制尚未完全闡明。本研究從網絡藥理學出發,篩選金匱腎氣丸的主要活性成分及作用靶點,挖掘臨床患者肝衰竭已知的疾病靶點,根據網絡拓撲分析及信號通路富集分析金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在作用機制,為金匱腎氣丸治療肝衰竭的進一步探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 金匱腎氣丸靶點預測和篩選

通過文獻及TCMSP平臺中篩選出8味中藥的活性成分(滿足OB≥30%且DL≥0.18)及相應的靶點。從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索文獻中收集的化學成分,利用SEA數據庫(http://sea.bkslab.org)、SwissTargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測其靶點。

1.2 肝衰竭相關基因的收集

基于GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)檢索“liver failure”,對于Genecards數據庫來源的數據篩選分數>14的結果,獲得肝衰竭相關基因。

1.3 網絡構建及核心靶點的篩選

在Venny 2.1.0軟件中(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對金匱腎氣丸活性成分的潛在靶點和肝衰竭相關基因取交集,且繪制韋恩圖。利用Cytoscape_3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org/)進行“化合物-靶點-疾病”網絡的構建,并將金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在靶點上傳至STRING數據庫中(https://www.string-db.org/),進行高置信度的靶點蛋白互作關系分析,在Cytoscape_3.7.2軟件中構建PPI網絡,根據介數中心性(Betweenness Centrality,BC),中心接近度(Closeness Centrality,CC),以及連接度值(Degree)的中位數來篩選核心靶點。

1.4 生物信息學分析

利用DAVID數據庫對潛在治療靶點進行GO分析和KEGG分析,設定物種為人,設置閾值:Pvalue<0.05。基于Cytoscape_3.7.2軟件繪制“化合物-靶點-通路”網絡[11]。

2 結果

2.1 金匱腎氣丸活性成分收集及肝衰竭相關基因的獲取

通過文獻及TCMSP平臺共得到金匱腎氣丸82個活性成分,通過TCMSP平臺、SWISS數據庫、SEA數據庫預測成分靶點,去除重復后共得到871個靶點。基于Genecards數據庫、OMIM數據庫篩選出肝衰竭相關的疾病靶點547個。

2.2 韋恩圖的制作

利用Venny 2.1.0軟件,將金匱腎氣丸成分靶點與肝衰竭疾病靶點分別導入,分析得到76個中藥-疾病共同靶點基因,即金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在靶點,繪制韋恩圖,如圖1所示。

圖1 藥物-疾病共同靶點韋恩圖

2.3 “化合物-靶點-疾病”網絡的構建

在Cytoscape_3.7.2軟件中構建金匱腎氣丸治療肝衰竭的“化合物-靶點-疾病”網絡,如圖2所示,網絡中共有159個節點和2 113條邊,涉及82個活性成分和76個靶點,其中藥物作用靶點用紫色節點表示,活性成分用綠色、藍色及粉色節點表示。經文獻檢索進一步篩選出藥理活性較好的18個核心成分見表1,分別來源于熟地黃的成分地黃苷A(Rehmannioside A,M1)、野菰酸(Aeginetic acid,M2)、海膽苷(Echinacoside,M3);來源于附子的成分烏頭堿 (Aconitine,M4)、新烏頭堿 (Mesaconitine,M5);來源于桂枝的成分表兒茶素 (Epicatechin,M7)、肉桂酸(Cinnamic acid,M8);以及來源于山藥的山藥素Ⅰ(Batatasin I,M17)、谷氨酸(Glutamic acid,M18)等。

表1 金匱腎氣丸核心活性成分信息

圖2 “化合物-靶點-疾病”網絡圖

2.4 金匱腎氣丸治療肝衰竭靶點PPI網絡構建及核心靶點的篩選

構建金匱腎氣丸治療肝衰竭靶點PPI網絡,如圖3所示。根據BC≥0.004 856 45,CC≥0.553 030 3,以及Degree≥20篩選出30個核心靶點。其中節點的大小和顏色與Degree值正相關,Degree的大小決定了靶點在此網絡關系重要性。表2展示了Degree≥21的IL-6(29)、VEGFA(29)、JUN(26)、MMP9(26)、EGFR(26)、MTOR(26)等20個核心靶點的信息。推測以上靶點可能在金匱腎氣丸治療肝衰竭中發揮重要作用。

表2 金匱腎氣丸治療肝衰竭的核心靶點拓撲分析信息

圖3 高置信度PPI網絡分析

2.5 生物信息學分析

利用DAVID數據庫對金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在作用靶點進行GO和KEGG分析。其中有465個GO項目顯著富集,360個在BP(生物過程)中富集,33個在CC(細胞組分)中富集,72個在MF(分子功能)中富集(圖4)。包括氧化還原酶活性、T細胞受體信號通路、細胞生長的調節、絲氨酸型內肽酶活性、活化T細胞增殖、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、炎癥反應、免疫反應等。

圖4 交集靶點GO富集分析

KEGG通路顯著富集138條,其中與炎癥與免疫相關通路有HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路、TNF信號通路、B細胞受體信號通路、NF-κB信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等;與細胞增殖和凋亡相關信號通路包括PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、Rap1信號通路、ErbB信號通路;與病毒感染相關信號通路包括乙型肝炎、丙型肝炎、冠狀病毒病-新冠肺炎等;以及與其他機制相關信號通路包括癌癥的途徑、肝細胞癌、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑、非酒精性脂肪肝等。基于文獻和現有研究,篩選出其中10個關鍵通路,并繪制富集氣泡圖(圖5)。以上結果表明金匱腎氣丸可通過調節多個生物過程及多個通路的協調作用來治療肝衰竭。“化合物-靶點-通路”網絡(圖6)共有100個節點和2 394條邊,涉及30條KEGG通路和52個靶點,說明金匱腎氣丸治療肝衰竭的藥理過程涉及多靶點、多途徑。

圖5 交集靶點KEGG富集分析

圖6 金匱腎氣丸治療肝衰竭的“化合物-靶點-通路”網絡

3 討論

肝衰竭是臨床常見的嚴重肝病癥候群,病死率極高。在我國引起肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(尤其是乙型肝炎病毒),其次是藥物及肝毒性物質(如酒精、化學制劑等)[1]。雖然目前肝衰竭病死率隨著抗病毒、人工肝、肝移植等方法的應用,有了一定程度的下降,但仍存在社會、經濟、血源和肝源的困擾,人工肝及肝移植在我國尚難普及,肝衰竭的病死率仍高達50%～70%[12],探尋治療肝衰竭的有效途徑仍是當前醫藥領域廣泛追求的目標。

祖國醫學中并無肝衰竭病名,其證候多屬本虛標實,實證中以毒、熱、濕、瘀為主,虛證以陽虛、氣虛、陰虛最為常見[13]。金匱腎氣丸廣泛應用于臨床,其配伍特點有三:一是補陽之中配伍滋陰之品,陰中求陽,使陽有所化;二是少量補陽藥與大量滋陰藥為伍,旨在微微生火,少火生氣;三是補中有瀉,以補為主,以瀉助補。故取其助陽亦化氣、利濕亦化濁、滋陰亦清熱之功,收陰陽共調、攻補兼施、標本同治之效。

目前金匱腎氣丸已被證實的化學成分主要為生物堿類、三萜類、環烯醚萜苷類、單萜類、倍半萜類、氨基酸類、酚類、苯丙素類、黃酮類等[14-15]。現代藥理研究進一步闡釋了金匱腎氣丸的藥理作用,附子辛甘大熱,為諸藥之首,其含有M4、M5等化學成分,為C19-二萜生物堿中的雙酯型生物堿的主要活性成分,具有抗腫瘤的藥理作用[16];桂枝辛甘而溫,為溫通陽氣之要藥,與附子共為君藥,周碩等[17]研究了桂枝中活性成分對體溫的雙向調節作用,桂枝煎劑及桂枝活性成分中的M8等均對小鼠的體溫發熱癥狀有效緩解;方中重用熟地滋陰補腎,取陰中求陽之效,與山茱萸、山藥共為臣藥,于震等[18]采用ip環磷酰胺造成小鼠白細胞減少,用M1進行治療,以小鼠體質量、外周血象、網織紅細胞數、骨髓有核細胞數和DNA量為觀察指標,結果表明M1對骨髓造血功能和外周血細胞增殖具有促進作用,可增強免疫功能;山茱萸的活性成分M15可使NF-κB失活和Aβ25-35誘導的PC12細胞中MAPK磷酸化而減輕神經炎癥反應[19];山藥中含有豐富的氨基酸,其中含量最多的是M18,具有抗氧化、調節酸堿平衡、抗突變的作用[20-21];方中茯苓、澤瀉、牡丹皮三藥合用,寓瀉于補,俱為佐藥,研究表明茯苓的化學成分M12可抑制脂多糖誘導的肺泡上皮細胞氧化應激損傷和凋亡反應,其機制可能與激活Nrf2/Keap1/ARE信號通路有關,從而發揮抗氧化的作用[22];陸璐[23]通過實驗證實M13可激活OGD/R誘導損傷bEnd.3細胞中的PI3K/AKT通路,表明M13可介導該通路發揮改善OGD/R損傷引起的炎癥反應及細胞凋亡的作用;M9能有效調節肝星狀細胞癌NF-κB作用,誘導腫瘤細胞凋亡,促進其抗腫瘤作用發揮[24]。諸藥合用,助陽之弱以化水、滋陰之虛以生氣,振奮陽氣、氣化復常,則諸癥自除。綜合以上現代藥理作用的研究,金匱腎氣丸具有抗腫瘤、抗炎與免疫調節、抗氧化、調節體溫、抗突變等藥理作用。

通過構建PPI網絡,對金匱腎氣丸治療肝衰竭的靶點進行了網絡拓撲學分析,結果顯示FOS、PPARA、CTNNB1、MTOR、JUN、MMP9、MAPK8等靶點度值較高。經過生物信息學分析及篩選后發現,金匱腎氣丸治療肝衰竭的過程主要涉及10個關鍵通路,其中炎癥與免疫相關通路有TNF信號通路、HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路;與細胞增殖和凋亡相關信號通路包括ErbB信號通路、PI3K-Akt信號通路;與病毒感染相關信號通路包括乙型肝炎、丙型肝炎;以及與其他機制相關信號通路包括癌癥的途徑、肝細胞癌、癌癥中PD-L1表達和PD-1檢查點途徑。肝臟發生損傷時,肝細胞受到刺激信號,并迅速傳導至細胞質內,IκB蛋白被降解,NF-κB大量轉入細胞核,結合DNA上κB位點,啟動其相關調控基因,發生轉錄,釋放、上調相應表達產物(如炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6),隨之局部炎癥反應被激活、放大[25];在盲腸穿刺的小鼠膿毒血癥模型中,通過抑制劑和基因敲減干預JAK2-STAT3通路,可有效阻斷核轉錄因子NF-κB激活,提高小鼠的生存率,表明其具有抗炎調控的作用[26]。趙士齡等[27]經過體內外研究發現,氯胺酮處理胃癌細胞導致Bcl-2蛋白水平下降,同時Bax、caspase-3活性增強,進而誘導細胞凋亡,并能夠使PI3K、AKT蛋白的磷酸化水平降低,有效抑制體內外腫瘤生長,且研究證明,PI3K/Akt/mTOR 通路能促進腫瘤細胞的生長、增殖和存活,同時對自噬產生負調控作用[28]。MUHLBAUER等[29]研究了肝組織內肝細胞、星狀細胞和庫普弗細胞表面抑制性受體PD-1的配體的表達水平,結果表明肝組織內這些細胞借助病毒感染,活化的T細胞以及1型干擾素能夠上調細胞表面PD-L1的表達水平,因此,PD-1/PD-L1信號通路在調控肝組織內免疫活性細胞、病原體與免疫應答相互作用方面發揮關鍵作用。金匱腎氣丸通過對多種癌癥通路的調控說明了對可治療不同類型的癌癥疾病;參與凋亡通路可促使癌癥細胞凋亡,抑制癌癥細胞生長;且肝衰竭的主要病因是肝炎病毒感染,金匱腎氣丸同時參與炎癥與免疫相關通路以及肝炎病毒相關通路,因此在肝衰竭的治療中有著重要的作用。

綜上所述,金匱腎氣丸主要作用于IL-6、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR、MTOR等靶點,通過炎癥與免疫、細胞增殖與凋亡、病毒感染、其他機制等多種途徑來實現治療肝衰竭的目的。本研究采用網絡藥理學方法,構建和分析PPI網絡以及“化合物-靶點-疾病”網絡,預測并闡述了金匱腎氣丸治療肝衰竭的潛在作用機制,為后續金匱腎氣丸的臨床與基礎研究提供新的理論依據。