基于TLR4/NF-κB/ICAM-1信號通路探討桑杏湯對急性肺損傷作用機制

程 慧,宋 僑

(襄陽市中醫醫院,湖北 襄陽 441000)

機體炎癥反應和氧化應激失衡是造成急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)的主要原因,臨床表現為肺水腫、咳嗽咳痰、胸悶[1-2]。現代醫學中急性肺損傷以對癥治療為主,如予以氨溴索注射液祛痰止咳,糖皮質激素抗炎[3]。而傳統中醫藥治療肺部疾病經驗豐富,可以通過多途徑、多靶點等特點發揮療效[4]。

桑杏湯由桑葉、貝母、杏仁等8味中藥組成,常用于治療肺部疾病,具有潤肺止咳,清宣溫燥等功效。主要有效成分為苦杏仁苷、綠原酸、貝母素A、貝母素B、蘆丁等[5]。本研究以桑杏湯組方為基礎,結合其有效成分,以細胞因子釋放為切入點,以急性肺損傷大鼠的炎性介質IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR4/NF-κB/ICAM-1信號通路的影響為研究對象,探討該組方對ALI的作用機制。

1 材料

1.1 藥品

桑杏湯組成:桑葉3g,梔子皮3g,梨皮3g,香豉3g,浙貝母3g,沙參6g,杏仁6g。除梨皮外所有飲片購自襄陽市中醫醫院,經專家鑒定為正品,正常煎煮濃縮至50mL,相當于生藥0.54g/mL。陽性對照藥:甲潑尼龍片(批號:202603,天津天藥藥業有限公司)。

1.2 動物

SD大鼠40只,雄性,體質量(200±20)g,購于湖北省實驗動物研究中心,許可證號:SYXK(鄂)2019-0009。

1.3 儀器與試劑

離心機(上海安亭科學儀器廠),旋轉蒸發儀(河南御華科技公司),顯微鏡(梅特勒中國公司),酶標儀(美國BeckmanCourt公司),脂多糖(LPS)液(美國艾斯本技術有限公司,批號:AS1044),白細胞介素-6(IL-6),大鼠白細胞介素-1β(IL-1β),蘇木素-伊紅HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號G1220);腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(中生北控生物科技有限公司產品,批號:080831,091071,080621),兔抗NF-κB,TLR4,ICAM-1(美國ABCAM公司,貨號:AB29849,AB17191,MRNA反轉錄試劑盒,熒光定量PCR試劑盒(上海生工生物科技有限公司);由上海生物工程有限公司設計合成的ICAM-1、TLR4、NF-κB引物。

2 方法與給藥

2.1 動物造模與評價

2.1.1 動物分組與 ALI模型 40只雄性大鼠進行7天適應性喂養,共分為4組,每組10只,分別為空白對照組、模型組、桑杏湯組和甲潑尼龍組。各組大鼠除空白對照組外,均采用LPS的腹腔注射方法建立ALI模型[6-7]。空白對照組和模型組給予0.9%生理鹽水,甲潑尼龍溶液濃度配置為0.4mg/mL,每組大鼠用1mL/100g的給藥容積進行灌胃。

2.1.2 支氣管黏膜病理學檢查 4組每組隨機抽取3只鼠類處死,取出支氣管黏膜,生理鹽水沖洗干凈,擦干后固定在10%福爾馬林溶液中,浸蠟脫水,包埋脫蠟切片,洗脫不同梯度乙醇,染色脫水封片,對氣管支氣管黏膜病理學變化進行顯微鏡下觀察。

2.2 血清炎癥因子檢測

白細胞介素-6(IL-6),白細胞介素-1β (IL-1β),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,按ELISA法在血清中檢測。

2.3 Western Blot法定量檢測TLR4/NF-κB/ICAM-1蛋白的表達方法

將肺組織切碎,勻漿,裂解,離心,電泳,加一抗4℃隔夜孵育,然后用TBST緩沖液洗凈,再加相應的二抗,然后再用TBST洗滌洗凈。利用化學發光法顯色,用Image J軟件測定各條帶灰度值,以各樣品與對應內參灰度值的比值來表示蛋白質相對含量。

2.4 PCR法檢測TLR4/NF-κB/ICAM-1mRNA水平

采用TRIzol法先提取出大鼠肺部細胞中總RNA,并將總RNA逆轉錄為相應的cDNA,再以cDNA為模板,利用RT-qPCR法進行DNA擴增,PCR反應條件設置為50℃ 1min,95℃ 8min,95℃ 10s,60℃ 33s,40個循環。繪制溶解曲線,用2-△△Ct法繪制溶解曲線并進行資料分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 數據分析

3 結果

3.1 各組鼠肺組織HE染色結果

在空白對照組中觀察大鼠支氣管黏膜病理形態學變化,可發現大鼠支氣管上皮細胞完整,各層結構清楚,沒有炎癥細胞;炎性細胞浸潤可見于模型組大鼠支氣管黏膜上皮細胞周圍;大鼠氣管支氣管黏膜炎癥浸潤桑杏湯組和甲潑尼龍組,上皮細胞病變較模型組明顯減輕,結果見圖1。

圖1 各組大鼠氣管支氣管黏膜組織發生的病理改變

3.2 支氣管炎大鼠血清炎性因子受桑杏湯影響

與空白對照組比較,模型組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)(P<0.05,P<0.01)含量均有明顯增加;桑杏湯組和甲潑尼龍組與模型組相比,大鼠血清白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(P<0.05,P<0.01)的含量均有明顯下降,具體情況見表2。

表2 各組大鼠血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

3.3 桑杏湯對各組蛋白質表達的影響(TLR4,NF-κB,ICAM-1)

與空白對照組相比,模型組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB和ICAM-1的蛋白質灰度值和陽性表達率均有較大幅度上升(P<0.05,P<0.01);桑杏湯組、甲潑尼龍組大鼠肺組織與模型組相比,TLR4、NF-κB和ICAM-1蛋白灰度值和陽性表達率均有較大幅度的降低,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01),實驗結果如表3所示。

表3 各組大鼠肺組織的水平比較(TLR4、NF-κB和ICAM-1)

3.4 桑杏湯對各組大鼠肺組織(TLR4,NF-κB和ICAM-1)mRNA的表達

與空白對照組相比,模型組大鼠肺組織中的NF-κB、TLR4和ICAM-1三種mRNA表達方式有顯著提高(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,NF-κB、TLR4和ICAM-1三種mRNA表達方式在甲潑尼龍組和桑杏湯組的大鼠肺組織中明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01),實驗結果如表4所示。

表4 大鼠肺組織中的TLR4、NF-κB和ICAM-1mRNA在各組的表達

4 討論

中醫治療肺病經驗豐富,源遠流長,如張仲景創制的射干麻黃湯、小青龍湯、麥門冬湯等[8],起源于清代吳鞠通所著《溫病條辨》的桑杏湯,具有止咳平喘、輕宣溫燥等功效,是治療溫燥病證的經典方。臨床中多用于治療肺燥咳嗽、脈浮數、舌紅少津等證。方劑由桑葉、杏仁、香豉、沙參、梔子、象貝、梨皮組成,其中桑葉、杏仁為主藥,有效成分為苦杏仁苷、蘆丁、貝母素甲、貝母素乙、綠原酸等,具有鎮咳平喘、抗菌、消炎、抗氧化等功效[9-10]。

TLRS受體與I型白細胞介素受體結構同源,同時具有相同的信號轉導途徑,因此在免疫應答和炎性反應中具有極其重要的作用[11]。TLR4是TLRs受體之一,為識別脂多糖主要受體[12]。當TLR4受到LPS的持續刺激而激活下游的NF-κB信號通路樞紐位置時[13],NF-κB是一種重要的核轉錄因子,而細胞間黏附分子1(ICAM-1)屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族的一員,有研究表明ICAM-1的表達受NF-κB調控。故當機體發生炎癥感染后,NF-κB 調控相關炎性因子并使其誘導、活化,促使相關抗原陽性白細胞黏附于ICAM-1 陽性內皮細胞表面,進一步到達炎癥組織,促進炎癥細胞的遷移和趨化進而導致 IL-1β、IL-6、 TNF-α等炎癥因子過度表達與分泌[14]。

本研究中,大鼠經LPS誘導后,大鼠的炎癥因子 IL-1β 和 IL-6、TNF-α的明顯過度分泌。研究發現,IL-1β通過促進T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖、誘導宿主炎癥反應和免疫應答[15],而 IL-6 是一種促炎細胞因子,能夠直接參與機體的炎癥反應,TNF-α是炎癥啟動因子,能夠誘導、上調炎癥細胞因子與趨化因子,促使炎癥細胞侵入感染部位。

本研究通過ELISA檢測法對大鼠外周血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量進行LPS誘導支氣管炎模型檢測,結果發現桑杏湯組能有效降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。采用Western Blot 和定量考察炎性介質 TLR4、NF-κB 和 ICAM-1等蛋白在模型大鼠肺組織中的表達情況,桑杏湯組肺組織中TLR4、NF-κB和ICAM-1蛋白和mRNA表達水平與模型組相比明顯減少。同時HE染色結果也表明桑杏湯組可以減少肺組織的炎性浸潤,緩解氣道和肺部炎癥癥狀。