基于非靶向代謝組學的訶子解草烏心臟毒性機制分析

圖布新,姜艷麗,烏日漢,胡伊力格其,劉錦文,韓曉靜,阿都沁夫,白梅榮*

(1.內蒙古民族大學 蒙醫藥研發工程教育部重點實驗室,內蒙古 通遼 028000;2.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院,內蒙古 呼和浩特 010010;3.內蒙古民族大學 護理學院,內蒙古 通遼 028000)

訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.、絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.或恒河訶子TerminaliachebulaRetz.var.gangeticaRoxb.的干燥成熟果實[1],是蒙醫最常用的藥物,享有“額莫音·芒來、浩日音·達日嘎”的美譽[2],蒙古語意為蒙藥之王和解毒之王。草烏是毛茛科系北烏頭AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥塊根[2],有大毒。由訶子解草烏毒是蒙醫用藥特色[3]。縱觀訶子解草烏毒性研究報道發現,訶子鞣質能緩和烏頭堿的水解或改善線粒體功能,從而減少草烏毒性,降低不良反應[4-6]。但尚未見從代謝組學角度分析訶子解草烏心臟毒性機制的研究報道。因此,本實驗以大鼠為研究對象,以草烏訶子藥對為示例藥物,以代謝組學方法分析訶子解草烏心臟毒性過程中的心臟內源性代謝產物變化規律,尋找訶子解草烏心臟毒性的生物標志物,為草烏的安全合理應用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SD雄性大鼠,SPF級,體質量為(200±20)g,由遼寧長生生物技術股份有限公司提供(SCXK(遼)2021-0001)。飼養條件:室溫維持(23±1)℃,光照12h,自由飲水、攝食。

1.2 藥品與試劑

草烏與訶子由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供,并由包桂花教授鑒定;純化水(屈臣氏集團有限公司);肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)試劑盒均購自羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.3 儀器

Eppendorf N13462C型移液器(德國Eppendorf公司);TripleTOF5600+質譜儀MASS(AB SCIEXTM公司);Mikro 220R型臺式高速冷凍離心機(Hettich公司);TL-48R型粉碎研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司);Nexera UHPLC LC-30A色譜UHPLC(島津SHIMADZU公司)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及取材

取大鼠50只,按體質量隨機分為正常組(ZC)、草烏高劑量組(CG,0.514 3g/kg,臨床等效劑量4倍)、草烏低劑量組(CD,0.032 1g/kg,臨床等效劑量1/4倍)、草烏訶子藥對高劑量組(CHG,0.514 3g/kg,臨床等效劑量4倍)、草烏訶子藥對低劑量組(CHD,0.032 1g/kg(臨床等效劑量1/4倍),每組10只。從實驗第1天開始,給藥組灌胃給予相應的藥物溶液,每日1次,連續28d;正常組灌胃等容積生理鹽水。最后一次給藥后,麻醉動物,測定心率及心電圖;從腹主動脈取血,3 500r/min離心15min分離血清,待測心臟功能生化指標;取部分心臟組織固定于10%甲醛溶液,待觀察病理學變化;取凍存部分心臟組織待分析其心臟內源性代謝產物。

2.2 代謝物提取

分別稱取心臟組織0.3g于PE管中,加入1 000μL甲醇,制備勻漿液,4℃ 12 000rpm/min離心15min,取上清過0.22μm有機濾膜,10μL進樣,采用UPLC-MS檢測。

2.3 UPLC-MS檢測

色譜條件:采用SHIMADZU InerSustain C18色譜柱(100mm×2.1mm,2μm)。流動相A∶乙腈,B∶0.1%甲酸水溶液,流速0.3mL/min,柱溫35℃,進樣量10μL。洗脫梯度:95%～30% B,0～7min;30%～0% B,7～13min;0%～95% B,13～16min。

質譜參數條件:采用電噴霧電離源條件如下:離子源Gas1:50,離子源 Gas2:50,界面加熱溫度:500℃(正離子)和450℃(負離子),離子噴霧電壓浮動5 500V(正離子)和4 400V(負離子),氣簾氣壓力:25,TOF質量掃描范圍:100～1 200Da,產物離子掃描范圍:50～1 000Da,產物離子掃描累積時間0.01s,TOF MS 掃描累積時間0.2s,二級質譜采用 Information Dependent Acquisition獲得,并采用High Sensitivity模式,碰撞能量:(35±15)eV,去簇電壓:±60 V。

2.4 數據處理

3 結果

3.1 多元統計分析

3.1.1 心電圖及心率檢測結果 在給藥28d后,與正常組相比較,CG組大鼠心率出現明顯降低(P<0.05),見表1。心電圖結果顯示,與正常組相比較,CG組呈現心律失常,室早,寬大畸形的QRS波;CD組出現寬大畸形的QRS波;CHG組出現ST段壓低;CHD組偶見ST段抬高。見圖1。

圖1 各給藥組大鼠的心電圖

表1 草烏及草烏加訶子藥對組大鼠心率的影響

3.1.2 血液生化指標檢測 與ZC組比較,CG組CK、CKMB含量顯著降低(P<0.05);但草烏訶子藥對CK、CKMB含量無明顯變化。提示,草烏具有一定的心臟毒性,訶子具有降低草烏心臟毒性作用。結果見表2。

表2 各給藥組對大鼠生化指標的影響

3.1.3 心臟組織病理檢測 病理檢測結果顯示,正常組心肌纖維排列整齊規則,胞核呈藍色,胞質呈淡粉色,細胞結構清晰。CG組和CD組心肌纖維排列略紊亂,胞質疏松淡染,部分細胞水腫;CHG組個別心肌細胞水腫;CHD組心肌纖維排列紊亂,胞質疏松淡染。見圖2。

圖2 各組病理切片(HE×400)

3.1.4 PCA分析結果 PCA是可觀察樣品的聚集、離散程度的圖像。與ZC組比較,CG和CHG組的大鼠心臟代謝物呈分離,見圖3。利用MetaboAnalyst軟件對各組熱圖進行聚類分析,發現ZC組與CG和CHG組的代謝物相對豐度有明顯差異。表明,草烏高劑量可使大鼠心臟代謝物發生一定變化。見圖4。

圖3 高劑量組心臟代謝物 PCA分析

圖4 高劑量組心臟代謝物熱圖

3.1.5 PLS-DA分析結果 與ZC組比較,CG和CHG組大鼠心臟代謝物能完全分離,見圖5。說明CG和CHG組大鼠心臟代謝物譜有顯著差異。

圖5 高劑量組心臟PLS-DA分析

3.1.6 單變量分析 標紅的點為具有顯著差異的代謝物,提示,與ZC組比較,CG和CHG組心臟代謝物存在顯著差異。見圖6。

圖6 高劑量組心臟火山圖

3.2 差異代謝物的篩選

與ZC組比較,CG組差異代謝物共18個,其中上調代謝物4個,下調代謝物14個,詳見表3。與ZC組比較,CHG組差異代謝物共25個,其中上調代謝物1個,下調代謝物24個,詳見表4。

表3 CG組心臟差異代謝物鑒定結果 (VIP≥1和P<0.05)

表4 CHG組心臟差異代謝物鑒定結果 (VIP≥1和P<0.05)

3.3 通路富集分析

將差異代謝物導入MBRole 2.0分析并獲得主要的代謝通路有ABC轉運蛋白、精氨酸生物合成、組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等通路,見圖7。

圖7 心臟代謝通路

3.4 結語

本實驗結果表明,訶子解草烏心臟毒性作用較明顯,調節心臟N、N-二甲基精氨酸和腺苷蛋氨酸及肌酸代謝產物是訶子解草烏心臟毒性的主要機制。

3.5 討論

NICHOLSON[7]首次提出了代謝組學的概念。代謝組學是分析藥物對生物體的內源性代謝產物的表達,從小分子水平上揭示藥物的療效或毒效的分析方法[8]。近年來,代謝組學在藥物心臟毒性研究,尤其在心臟損傷標志物篩選、毒性機制及心臟損傷防治等研究中已被廣泛應用[9]。

CK主要分布于骨骼肌、心肌、腦甲狀腺、肺組織、胃腸平滑肌中,在磷酸肌酸合成途徑中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用。即人體合成肌酸過程為依賴甘氨酸脒基轉移酶和胍基乙酸N-甲基轉移酶這兩種生物酶的催化作用,以甘氨酸、精氨酸和S-腺苷蛋氨酸為主要原料,合成肌酸。提示,血清CK含量的異常表達也與肌酸、甘氨酸、精氨酸和S-腺苷蛋氨酸表達異常有一定相關。

實驗結果顯示,草烏致心率和心電圖異常,升高血清CK含量、引起明顯的心肌細胞胞質疏松及細胞水腫的表征均與心臟組織中N、N-二甲基精氨酸和腺苷蛋氨酸異常升高有關;訶子解草烏心臟毒性的機制主要與降低心臟組織中肌酸有關。