缺氧誘導因子1α（HIF-1α）/Yes相關蛋白（YAP）在非酒精性脂肪性肝病中的調控作用

張華， 寇萱萱， 鄧婧鑫， 張建剛

蘭州大學基礎醫學院病理學研究所， 蘭州 730000

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指影像學檢查證實肝脂質沉積，且排除繼發性原因（如病毒、藥物、自身免疫等）和過度飲酒（男性≥30 g/d，女性≥20 g/d）［1］。中國目前有超過2.4億人患有NAFLD，占全球NAFLD人口的1/5以上［2］。NAFLD的病變涵蓋范圍較廣，從單純性脂肪變（NAFL）到非酒精性脂肪肝炎（NASH），以及后期進展為肝纖維化/肝細胞癌。此外，很大一部分NAFLD患者同時合并代謝綜合征。缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIF）是由α、β兩種亞基組成的堿性螺旋-環-螺旋同源域家族的轉錄因子，即主要活性亞基（HIF-1α和HIF-2α）和結構亞基（HIF-1β）組成的異源二聚體，在調控細胞代謝、增殖方面發揮作用。Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）為Hippo信號通路下游效應因子，通過與轉錄增強子相關域（transcription enhancer associated domain，TEAD）家族轉錄因子結合來調節DNA轉錄，作為轉錄共激活因子，調控細胞增殖分化。最近，HIF-1α與YAP在NAFLD中的作用已逐漸引起關注。

1 HIF-1α與缺氧環境

HIF-1α是調節器官、組織、細胞適應缺氧微環境的首要因子。在常氧條件下，脯氨酰羥化酶（prolylhydroxylases，PHD）羥化HIF-1α氧依賴性結構域的脯氨酸殘基，被羥基化的HIF-1α在胞質中由腫瘤抑制蛋白介導，經E3泛素連接酶泛素化后發生蛋白酶體降解。在低氧（O2＜5%）條件下，PHD活性被抑制，穩定積累的HIF-1α與HIF-1β形成異二聚體并易位于細胞核，與缺氧反應元件結合后調控血管生成因子、促紅細胞生成素、葡萄糖轉運蛋白等促血管生成及代謝基因轉錄。除低氧環境引起HIF-1α轉錄活性上調之外，病毒、細菌誘導的氧化應激及寄生蟲介導的鐵損耗可直接上調HIF-1α轉錄活性［3］。此外，活性氧自由基（ROS）、機械刺激最近也被認為與HIF-1α活性上調相關。

2 YAP結構與功能

YAP是轉錄激活的輔助因子。Yes是一種Src家族蛋白酪氨酸激酶。1995年，Sudol鑒定并克隆出與Yes原癌基因產物Src同源結構域3結合的蛋白，該蛋白分子量為65 kD，富含脯氨酸，將其命名為Yes相關蛋白。YAP沒有明確的DNA結合域，因此作為轉錄共激活因子與TEAD結合調控下游靶基因表達。Hippo酶聯反應是最基本的YAP表達調節信號；當Hippo通路激活時，哺乳動物STE20樣激酶（MST1/2）與調節蛋白SAV1結合形成活性激酶磷酸化并激活大腫瘤抑制激酶（LATS1/2），活化的LATS1/2磷酸化YAP（phosphorylates YAP，pYAP），pYAP在胞質中通過蛋白酶體途徑降解［4］，從而達到抑制器官過度增長的作用。當Hippo通路失活，YAP核易位與TEAD核轉錄因子結合調控基因表達。除經典Hippo通路，機械應力是調節YAP表達的另一因素，該因素似乎獨立于Hippo通路，可直接激活YAP。

3 NAFLD

NAFLD逐漸成為全球慢性肝病主要原因。NAFLD相關肝移植率和病死率逐年增加，與肝外并發癥共存相關，2型糖尿病患者的NAFLD發病率為47.3%～66.7%，肥胖患者中高達80%［5］。雖然NAFLD與上述因素呈密切相關性，但是其具體機制仍不清楚。從組織形態上觀察，NAFLD涵蓋疾病的一系列形態，包括伴有或不伴有輕度炎癥的脂肪變性和伴有肝細胞氣球樣變的壞死亞型。從病理機制上觀察，NAFLD是脂肪代謝合成功能紊亂的結果，肝臟是脂肪酸代謝的核心器官，主要通過血漿攝取及從頭生物合成兩種方式促進脂肪酸積累；正常情況下，肝臟以甘油三酯形式儲存少量脂肪酸；而當脂肪生成增加或脂肪酸氧化減少則會導致肝脂質沉積［6］。脂質蓄積引起的脂毒性會導致肝細胞應激、凋亡、組織修復性再生和纖維形成，盡管研究發現脂質代謝障礙、炎癥等機制參與調節疾病過程，然而對其調控的下游機制仍需要進一步研究。

4 NAFLD與HIF-1α/YAP

NAFLD在不同疾病進展時期均有相應的分子機制參與調節，其中HIF-1α/YAP信號通路作用于疾病全程，并逐漸成為NAFLD機制研究熱點。除在肝細胞糖酵解中發揮關鍵作用，HIF-1α/YAP在脂質代謝重編程中也至關重要。YAP是一種強大的調節因子，受細胞生存環境變化而表達，在肝脂質積累、炎癥發生、膠原沉積過程具有調節作用，與HIF-1α結合促進HIF-1α穩定表達［7］，在脂質誘導肝細胞損傷修復中協調發揮作用。簡要介紹高脂飲食（high fat diet，HFD）及棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導HIF-1α/YAP軸激活在NAFLD及其相關纖維化中的病理機制（圖1）。

圖1 HIF-1α/YAP調控NAFLD相關機制Figure 1 Mechanistic diagram of HIF-1α/YAP regulation of NAFLD

4.1 NAFL與HIF-1α/YAP NAFLD是一種以肝細胞脂肪沉積為首發癥狀的疾病。長期攝入高脂肪飲食的小鼠肝臟出現疾病相關性缺氧，主要由肝細胞體積增加、肝臟組織血管床減少和消耗氧氣的脂肪酸代謝增加所導致。HIF-1α是組織缺氧后適應性改變的主要調節轉錄因子，可防止NAFLD進展過程中肝脂質積累。具體表現為，當肝細胞特異性HIF-1α缺陷時，會促進HFD小鼠肝脂質沉積［8-9］。高脂環境誘導HIF-1α表達增加的機制尚不清楚，ROS增加可能是其原因之一。肝臟作為脂質代謝最大器官，當發生脂肪代謝障礙，肝細胞脂質蓄積，引起線粒體氧化呼吸鏈電子傳遞泄漏，ROS水平升高，誘導HIF-1α轉錄活性激活，隨后上調的HIF-1α通過氧化還原因子的激活誘導PHD2，導致HIF-1α降低［10］。此外，HIF-1α通過誘導PDK1表達，促進有氧氧化轉換為無氧糖酵解，這種能量代謝失衡導致HIF-1α下調，促進NAFLD脂質沉積。這些結果表明肝脂肪變性與HIF-1α的調控有關，主要表現為早期高脂膳食誘導HIF-1α上調防止肝細胞脂肪變性，隨著高脂環境持續存在，HIF-1α活性下調，NAFL發生。Hippo信號通路調控YAP活性，除了控制器官大小和組織穩態，細胞分化、代謝重編程等生理過程也與Hippo通路有關。其中脂肪代謝重編程是YAP信號調節的中心點。YAP信號介導胰島素受體底物2與絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）信號下調，從而預防小鼠肝臟脂肪變性［11］，YAP和AKT協同作用維持肝脂質代謝穩態。YAP還直接與脂肪酸合成酶和30-羥甲基戊二酰輔酶A還原酶啟動子上的甾醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP-1c和SREBP-2）相互作用，刺激轉錄并誘導肝脂肪從頭生成增加［12］。與上述發現一致的是，YAP也可以抑制糖異生基因表達而減少脂肪酸消耗，間接促進脂肪酸積累［13］。同樣在飲食誘導的糖尿病小鼠中，進一步發現通過抑制YAP與SREBP-1c/SREBP-2之間相互作用可防止肝細胞脂質沉積和高脂血癥［12］。這表明YAP調控脂質代謝，與脂質沉積之間存在聯系。

4.2 NASH與HIF-1α/YAP 據統計［14］，在美國人群中有3%～6%的個體罹患NASH，在代謝性疾病和肥胖患者中更為普遍。NAFLD疾病進展過程中，NASH階段炎癥浸潤是導致纖維化的關鍵環節，高脂膳食、缺氧、代謝紊亂等是主要危險因素。隨著肝脂質沉積，肝細胞發生壞死，NAFLD從NAFL發展為NASH，肝Kupffer細胞在此過程發揮著重要作用。在高脂膳食引起的NASH中，游離脂肪酸是導致細胞損傷的脂毒性物質之一，主要通過內質網應激、氧化應激等不同途徑誘導肝細胞損傷。正常情況下，Kupffer細胞通過上調自噬來維持細胞脂質穩態［15］。飲食誘導的NASH小鼠模型中，Kupffer細胞的促炎作用與HIF-1α水平上調，這些改變與自噬通量減少相關［16］。該結果進一步在人體樣本中得以驗證，經檢測，NASH患者與健康對照者相比，Kupffer細胞數量顯著增加，HIF-1α上調，自噬通量受損［16］。HIF-1α通過自噬介導炎癥反應同樣在細胞中得以驗證，表現為下調肝Kupffer細胞中PA誘導的自噬通量，并上調Kupffer細胞引起的炎癥，這種炎癥由HIF-1α直接介導，而不是由自噬通量介導［16］。這種因HIF-1α和自噬軸失調導致的炎癥反應在NASH發展中扮演關鍵角色。另外，HIF-1α上調促進IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子信號釋放，激活肝細胞內炎癥小體/caspase-1，促進NASH發展［17］。

氧化應激在NASH肝細胞損傷中具有關鍵作用，各種來源的ROS驅動NAFLD進展。有實驗［18］表明，在高脂處理的肝細胞中，ROS可上調HIF-1α，促進缺氧誘導基因結構域家族成員1A的表達，減輕肝細胞高脂應激與損傷。而另一實驗［19］則證明，當HIF-1α反義寡核苷酸抑制小鼠HIF-1α表達后顯著降低肝脂質合成關鍵酶的表達，從而改善脂質穩態以及肝臟胰島素抵抗。體內、體外實驗結果相反，HIF-1α在NASH肝損傷中的作用仍有待于進一步闡明。

NAFLD脂質積累促進脂毒性與線粒體功能障礙，繼而引發肝細胞死亡、炎癥、纖維化，其中肝細胞死亡促進信號分子釋放［20］，是NASH炎癥進展的關鍵［21］，NASH和NAFL的本質區別是前者存在肝細胞大量死亡［22］，這種死亡常由游離脂肪酸誘導的脂毒性、內質網應激介導，因此，降低NASH階段脂毒性，可能是緩解肝細胞應激的策略之一。在PA誘導人肝癌細胞系HepG 2細胞脂毒性產生的早期階段，HIF-1α通過抑制內質網應激標志物防止HepG 2細胞凋亡；若HepG 2細胞持續暴露于PA，則觀察到這種保護效果消失［23］，此現象可能由信號通路負反饋抑制HIF-1α引起。

Kupffer細胞肝臟浸潤是促進HFD誘導的NASH發展重要因素［24-25］。除NOD樣受體蛋白3/caspase-1/IL-1β經典通路介導NASH發展之外，Kupffer細胞通過Hippo/YAP通路調節細胞存活與增殖［26］。研究［27］表明，HFD誘導的野生型NASH小鼠肝Kupffer細胞YAP以及YAP介導的單核細胞趨化蛋白1、TNF-α、IL-6等炎性因子上調，從而使肝臟炎癥進一步加重，YAP在Kupffer中調節NASH肝臟炎癥的作用為NASH治療提供新靶點。

肝細胞是驅動NASH發展的主要信號來源，肝細胞狀態轉換的潛在機制之一可能是YAP信號通路的激活［28］。NASH肝細胞中YAP活性增加誘導肝星狀細胞（HSC）轉分化為肌成纖維細胞，促進炎癥浸潤及肝臟纖維化，說明肝細胞YAP表達水平與肝臟炎癥、纖維化程度相關，并且肝細胞來源的巨噬細胞趨化因子作為YAP通路下游關鍵靶標，驅使巨噬細胞浸潤，促進NASH炎癥加重［29］。除此之外，一項關于NAFLD恒河猴的研究［30］發現肝細胞YAP的表達水平與肝脂肪變性和纖維化程度呈正相關，其機制是YAP通過調節TGF-β/Smad信號通路，促進肝臟由NAFL進展到NASH或者直接進展為肝纖維化。

4.3 NAFLD相關纖維化與HIF-1α/YAP NAFLD相關纖維化的疾病表型由環境、遺傳因素相互作用引起，肝細胞持續性脂肪沉積導致微循環灌注減少，引起肝臟損傷與損傷后修復，進而促進細胞外基質沉積。缺氧是HFD誘導肝細胞脂質沉積的結果與觸發因素，而HIF-1α是缺氧合并NASH相關肝纖維化的信號調節關鍵調控因子［31］。

肝細胞內HIF-1α信號轉導是NAFLD纖維化發生的重要因素。HFD喂養小鼠發生NASH，并伴有顯著的肝纖維化，而肝細胞特異性敲除HIF-1α，小鼠肝纖維化程度明顯減輕，膠原蛋白含量減少近80%［32］，HIF-1α對NAFLD纖維化的調控作用在小鼠模型中已得到證實［33］。體外實驗［32］進一步證明HIF-1α是NAFLD膠原交聯所必需，已證實肝細胞腫瘤抑制因子（phosphatase and tensin homolog，PTEN）下調可促進NAFLD纖維化，而HIF-1α作為上游關鍵調節機制，在PA誘導肝細胞脂質沉積細胞模型中，HIF-1α上調介導PTEN/NF-κB-P65信號通路促進膠原沉積。

肝內肌成纖維細胞積累是NAFLD纖維化中心環節，主要來源于活化的HSC，自噬、氧化應激、缺氧、脂質代謝和受體介導信號在內的多種途徑揭示HSC活化的復雜機制，HIF-1α是介導下游相關基因誘導HSC分化為肌成纖維細胞的信號之一［34］。研究［35］發現，HFD誘導的NASH小鼠HSC中HIF-1α表達升高時具有促纖維化作用，且與肝組織纖維化水平呈正相關。此外，研究人員在NAFLD患者肝臟樣本RNA測序結果中發現，YAP在纖維化階段表達上調。同時在HFD所致NAFLD小鼠肝臟中進一步證明，肝細胞特異性YAP敲除可降低NAFLD相關纖維化基因表達，表明YAP在NAFLD相關纖維化中具有致病作用［36］。

肝纖維化病理機制主要是損傷修復失衡及成熟肝細胞再生缺陷，多種信號調節反應肝細胞受損再生機制的復雜性。健康肝臟中，YAP調控肝體積大小與成熟細胞再生，在肝臟生長過程中有重要作用。在NAFLD肝臟中，YAP過表達并喪失調節肝組織正常再生功能；反應性導管細胞（reactive ductal cells，RDC）的積累與肝纖維化嚴重程度及肝硬化相關死亡風險密切相關；HFD誘導的NASH相關纖維化中YAP核陽性主要定位于RDC，這種細胞同時表達骨橋蛋白（osteopontin，OPN），是細胞外基質中的連接蛋白［37］。免疫組化雙重染色顯示OPN與YAP在NAFLD相關纖維化RDC核中同時強陽性表達，表明肝細胞損傷修復期間YAP上調促進RDC積累及OPN介導細胞外基質沉積，促進肝臟纖維化發展，而非功能型肝細胞有效再生［38］。HSC是細胞外基質主要來源，YAP同樣在活化的HSC中表達；肝纖維化階段細胞外基質沉積，細胞對基質剛度增加的感知會導致YAP核易位，HSC對基質感知依賴于整合素信號，YAP作為活化的HSC中整合素依賴性信號傳導的重要效應因子，調節整合素與細胞外基質互相作用的穩定性，促進NAFLD纖維化表型，動物實驗中抑制YAP后可改善纖維化［39］。

4.4 代謝相關脂肪性肝病（MAFLD）與HIF-1α/YAP NAFLD不僅僅是單純的肝臟疾病，常與肥胖、血脂異常、2型糖尿病及代謝綜合征密切相關［40-41］。因此NAFLD被認為是代謝綜合征在肝臟表現，屬于MAFLD范疇。而最新定義的MAFLD，是指肝內甘油三酯含量≥5%，并且存在以下三種情況之一，即超重/肥胖、糖尿病和代謝紊亂［42］。部分NAFLD病患常伴有糖尿病、高血壓、胰島素抵抗等并發癥。HIF-1α通過調控相關代謝變化促進NAFLD發展為MAFLD［43］，在上述并發癥中發揮重要作用。在幾項回顧性研究調查中發現，NAFLD患者常伴有心血管疾病［44-45］。動物研究［46］證明，HIF-1α是導致高血壓疾病模型中肝損傷易感性增強的原因，在長期HFD環境下，HIF-1α介導心血管疾病模型中NAFLD進一步加重。在NAFLD合并代謝綜合征中，有研究［47］顯示HIF-1α激活促進胰島素抵抗，然而也有研究［7］表明相反結果，即HIF-1α激活可防止肥胖和改善胰島素抵抗，這種不一致說明HIF-1α調控MAFLD存在個體差異，可能與HIF-1α翻譯后修飾相關。肝臟是許多生理代謝過程的關鍵樞紐，包括脂質和膽固醇穩態，然而，NAFLD肝臟功能被抑制，在脂肪變性的小鼠肝臟中，肝細胞HIF-1α通過介導水通道蛋白抑制肝細胞水分分泌，濃縮膽汁，促進膽固醇結石形成［48］，HIF-1α上調抑制膽汁代謝，促進NASH期間肝酶表達升高。肝臟通過調節葡萄糖和脂質代謝，在細胞代謝中發揮核心作用，NAFL合并胰島素抵抗是代謝失調的常見特征。Hippo通路失活導致多種代謝疾病發生［26］，YAP可抑制調節肝臟糖異生的基因轉錄，即通過下調葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1［13］，降低血糖水平，但同時間接抑制了肝臟脂質代謝。盡管HIF-1α/YAP調節NAFLD和糖代謝、脂代謝之間相關性的具體機制仍不清楚，但可從現有證據觀察到HFD通過HIF-1α/YAP軸促進NAFLD表型及相關代謝趨勢變化。

5 展望

NAFLD是嚴重的公共衛生問題，鑒于人口基數龐大及醫療條件有限，針對NAFLD患者的全面覆蓋診療方法似乎不能夠現實。且由于環境與基因互相作用，NAFLD疾病發展程度在不同患者間存在較大個體差異。因此，根據環境因素、易感基因、疾病發展程度將重點人員納入監護至關重要。雖然HIF-1α與YAP在NAFLD的研究中已經取得一些成果，但探索HIF-1α/YAP在不同階段如何調控疾病發展是解決NAFLD的關鍵。尤其是HIF-1α/YAP在NAFLD表觀遺傳學中的調控作用。此外，肝臟疾病中HIF-1α/YAP在不同細胞中的異質性值得關注。隨著研究人員對HIF-1α/YAP作用機制的不斷探索，該分子通路或許可以作為NAFLD患者易感基因的一個新靶點，開發出靶向該分子通路的藥物將為NAFLD的治療提供新的思路。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：張華負責擬定寫作思路并撰寫文章；寇萱萱、鄧婧鑫參與相關文獻及數據的收集與整理；張建剛審校并修改論文。