基質金屬蛋白酶7（MMP7）和硫酸乙酰肝素糖蛋白2（HSPG2）在胰腺癌中的表達及臨床意義

陳金鳳， 陸小柳， 張曉韻， 唐曦平

1 廣西醫科大學腫瘤醫學院， 南寧 530021； 2 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院內鏡中心， 南寧 530021

胰腺癌起病隱匿，早期診斷難度大，并且發展迅速，惡性程度極高。目前為止，在全世界范圍內還沒有針對胰腺癌的具有良好治療效果的藥物，胰腺癌患者的5年生存率尚未得到顯著改善，仍低于10%［1］。由于在早期診斷、預后、預測以及新的靶向治療方面缺乏重大突破，胰腺癌的主要治療方式仍為手術和化療，但只有約10%的患者具有早期手術的機會，因此，篩選胰腺癌早期診斷的分子標志物已成為國內外的研究熱點［2］。硫酸乙酰肝素糖蛋白2（HSPG2）是一種細胞外蛋白聚糖，與腫瘤血管的生成、增殖、分化和侵襲密切相關，且在多種腫瘤中呈高表達［3］。基質金屬蛋白酶（MMP）是一系列結構相關的鋅依賴性內肽酶，MMP7作為其中分子量最小的酶，在促進腫瘤浸潤和誘導血管生成中起著關鍵作用［4］。研究［5］顯示，MMP7能夠對perlecan進行酶促加工，進而共同加速組織侵襲和血管生成。HSPG2在胰腺癌中的表達以及MMP7與HSPG2在胰腺癌中的關系尚未見相關研究報道。本研究通過檢測胰腺癌患者組織和血清中MMP7及HSPG2的表達，同時對收集的患者臨床資料進行回顧性分析，以探討MMP7和HSPG2對胰腺癌診斷及判斷預后的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月—2020年12月廣西醫科大學附屬腫瘤醫院收治的，病理檢查證實為胰腺癌患者30例，其中男16例，女14例，年齡38～87歲。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；高分化4例，中低分化26例。收集30例患者的胰腺癌組織及血清樣本，并收集癌旁組織及30例健康志愿者血清樣本作為對照。收集相關臨床資料，隨訪時間截至2022年12月，回訪采用門診或住院復查的形式，配合電話隨訪，共隨訪1～39個月，以患者死亡作為隨訪的終點事件。

1.2 主要試劑及材料 HSPG2和MMP7多克隆抗體購自上海生工生物工程有限公司，免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。MMP7和HSPG2酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購自上海酶聯生物公司。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化法檢測組織中HSPG2和MMP7表達 收集醫院石蠟包埋標本，切片后常規脫水脫蠟，進行抗原修復、封閉，依次加入一抗、二抗孵育后DAB顯色，蘇木素染色，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片保存。免疫組化結果由兩位病理科醫師采用雙盲法判定陽性。

1.3.2 免疫組化染色評分 顯微鏡下隨機選取5個高倍視野進行評分。采用半定量積分法［6］綜合染色強度和陽性細胞百分比判斷結果。染色強度評分：無染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細胞百分比：0～5%計為0分，6%～25%計為1分，26%～50%計為2分，＞50%計為3分。免疫組化評分=染色強度評分×陽性細胞百分比評分，總分≤4分為陰性，總分＞4分為陽性。

1.3.3 ELISA法檢測血清中HSPG2、MMP7含量取-80 ℃保存的血清樣品解凍，HSPG2和MMP7嚴格按照ELISA試劑盒說明書方法進行檢測。酶標儀以450 nm波長讀取各孔吸光度，繪制標準曲線，計算出各樣品HSPG2和MMP7含量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統計學分析。計量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。MMP7與HSPG2表達的關系采用Spearman相關分析。采用Kaplan-Meier法分析MMP7和HSPG2不同表達情況下的生存率，并繪制生存曲線，生存情況比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP7和HSPG2在胰腺癌及癌旁正常組織中的表達 免疫組化結果顯示，MMP7和HSPG2表達均主要定位于細胞質中，陽性表現為腫瘤細胞胞質染色呈淡黃色至棕褐色（圖1）。30例胰腺癌患者組織切片中，HSPG2蛋白陽性表達的有22例（73.33%），在癌旁組織中僅1例陽性表達（3.33%）；MMP7蛋白陽性表達的有25例（83.33%），在癌旁組織中僅2例陽性表達（6.67%）。MMP7、HSPG2蛋白陽性表達在胰腺癌和癌旁組織中差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 MMP7和HSPG2在胰腺癌及癌旁正常組織中的陽性表達Table 1 Positive expression of MMP7 and HSPG2 in pancreatic cancer and normal adjacent tissues

圖1 胰腺癌組織及癌旁正常組織中MMP7、HSPG2的表達情況（免疫組化，×200）Figure 1 Expression of MMP7 and HSPG2 in pancreatic cancer tissues and in adjacent cancer normal tissues（immunohistochemistry， ×200）

2.2 MMP7和HSPG2表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 收集患者臨床資料進行回顧性分析，結果顯示，胰腺癌患者MMP7和HSPG2陽性表達在腫瘤直徑和TNM分期的差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（表2）。

表2 HSPG2和MMP7表達與胰腺癌臨床病理特征的關系Table 2 Relationship between HSPG2 and MMP7 expression and clinicopathological features of pancreatic cancer

2.3 MMP7和HSPG2表達的相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示，MMP7與HSPG2之間的表達呈正相關（r=0.539，P＜0.05）（表3）。

表3 HSPG2和MMP7表達的相關性分析Table 3 Correlation analysis of the expression of both HSPG2 and MMP7

2.4 各組血清中MMP7和HSPG2水平比較 胰腺癌患者血清中MMP7、HSPG2水平均高于健康對照組，差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（表4）。

表4 各組間血清中MMP7、HSPG2的表達水平比較Table 4 Comparison of expression levels of MMP7 and HSPG2 in serum between groups

2.5 MMP7和HSPG2表達與胰腺癌患者預后的關系 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結果顯示MMP7和HSPG2陽性表達胰腺癌患者的總體生存率低于陰性者，差異均有統計學意義（χ2值分別為4.084、12.554，P值均＜0.05）（圖2）。

圖2 MMP7、HSPG2蛋白表達與胰腺癌患者生存時間的關系Figure 2 Relationship between MMP7 and HSPG2 protein expression and survival time of pancreatic cancer patients

3 討論

胰腺癌侵襲性高，全身轉移時間早，是死亡率最高的腫瘤之一，在世界范圍內發病率呈上升趨勢［7-8］。分子生物標志物已越來越多地被用于協助診斷腫瘤疾病，鑒于胰腺癌的早期診斷以及治療難度，探索新的生物標志物，可為胰腺癌的發生發展以及早期確診提供新的理論依據和研究思路［9］。

MMP7屬于基質金屬蛋白酶家族，能夠對細胞生長和血管生成的信號轉導途徑進行調控，在多種腫瘤的發生發展中起重要作用，并可作為多種癌癥不良預后的預測因素［4］。已有相關研究表明，MMP7在結直腸癌［10］、胃癌［11］、乳腺癌［12］和前列腺癌［13］等多種腫瘤中具有顯著的差異表達水平。本研究結果顯示，MMP7在胰腺癌組織中的陽性表達與癌旁正常組織相比差異有統計學意義（P＜0.05），提示MMP7可能成為胰腺癌組織病理學診斷的潛在靶標。同時，本研究對胰腺癌患者的臨床病理特征進行了回顧性分析，發現MMP7陽性表達與腫瘤直徑、TNM分期密切相關，即MMP7在腫瘤直徑較小、分期較早時已經表現為陽性表達，這可能與MMP7促進腫瘤細胞生長以及血管形成的作用有關，提示其可能在胰腺癌的發生、發展中起重要作用。

HSPG2，也稱為perlecan，是一種多功能蛋白聚糖，由1個核心蛋白和3個長鏈的糖胺聚糖組成，是基底膜和細胞外基質的重要組成部分，并參與多種生物活性［14］。HSPG2可影響多種信號通路，從而發揮其在機體內的調控作用，相關研究［5，15-17］表明，HSPG2可以調節細胞生長、增殖和分化，細胞外基質黏附，促進血管生成與生長，參與組織發育和傷口愈合等生物學過程。Kazanskaya等［15］研究表明，HSPG2在膠質母細胞瘤表達上調，通過影響腫瘤微環境來促進腫瘤發育，并與患者的預后不良和低生存率有關。但HSPG2在胰腺癌中的研究報道罕見。本研究結果顯示，HSPG2在胰腺癌組織中表達升高（P＜0.05），與腫瘤直徑、TNM分期相關，且MMP7與HSPG2表達呈正相關（r=0.539，P＜0.05），提示MMP7和HSPG2可能共同參與了胰腺癌的發生發展，但二者間的具體調控機制還需分子生物學等實驗進一步驗證。本研究結果還顯示，胰腺癌患者血清中MMP7、HSPG2水平明顯高于健康對照組，鑒于血清樣本較易獲取，對患者傷害較小，提示其有望成為早期檢測胰腺癌的潛在標志物。生存分析結果表明，與陰性對照相比，MMP7和HSPG2陽性表達的胰腺癌患者的生存時間明顯降低（P值均＜0.05），提示MMP7和HSPG2陽性表達對判斷胰腺癌患者的預后具有一定的參考價值。

綜上所述，MMP7和HSPG2在胰腺癌組織中呈陽性表達，兩者間表達呈正相關，在腫瘤直徑較小、TNM分期較早時即表現為陽性表達，且陽性表達患者總生存率更低；此外，MMP7和HSPG2在胰腺癌患者血清中水平升高，有望成為胰腺癌早期診斷和判斷預后的潛在標志物。

倫理學聲明：本研究方案經由廣西醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會審批，批號：LW2023010。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：陳金鳳負責課題設計，資料分析，撰寫論文；陸小柳、張曉韻參與收集數據；唐曦平負責提供經費支持，設計研究思路，指導撰寫文章并最后定稿。