HPLC法同時測定茵梔解毒顆粒中3種有效成分的研究

鐘寒輝,王 彬,陳曉林,余功富,林仙軍*

(1.綠城農科檢測技術有限公司,杭州 310051;2.浙江省動物疫病預防控制中心,杭州 311101;3.臺州市路橋區橫街動物衛生所,浙江臺州 318020)

中獸藥茵梔解毒顆粒由5味藥材(茵陳、梔子、黃芩、虎杖和鉤藤)通過一定的生產工藝制得[1-2]。具有清熱解毒、疏肝解痙功效[3],獸醫臨床上用于雛鴨病毒性肝炎的治療[4-5]?！东F藥質量標準(2017年版)中藥卷》收載了該標準[1],標準采用4個薄層色譜系統,分別鑒別梔子苷、黃芩苷、茵陳對照藥材和虎杖對照藥材,操作繁瑣并且需要用到三氯甲烷、丙酮等多種管制試劑和一般有機試劑,試劑使用量也較大,對操作人員不友好。在含量測定方面,標準僅測定來自處方中茵陳的有效成分綠原酸的含量,評價藥物質量方面不夠全面。

高效液相色譜法作為一種較成熟的分離技術[6],具有分離速度快、效率高、靈敏度高[7-8]、定性定量準確等優勢[9-10],在獸藥檢驗和質量監控中發揮越來越大的作用[11-12]。本試驗采用高效液相色譜法對中獸藥茵梔解毒顆粒中梔子苷、黃芩苷和綠原酸同時檢測的方法進行了研究,建立方法的基礎上開展了實際樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司,型號1260,配G4212A檢測器);色譜柱(Agilent Eclipse XDB-C18,250 mm×4.6 mm,5 μm);電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司,型號AG-285);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司KQ-500E型)。

1.2 主要試劑 黃芩苷對照品(中國獸醫藥品監察所生產,批號為Z0271705,含量為96.8%);梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院生產,批號為110749-201115,含量為99.7%);綠原酸對照品(中國獸醫藥品監察所生產,批號為Z0261702,含量為98.3%)。茵梔解毒顆粒(浙江企業生產,批號為20210822、20210823和20210824等3批次)。

1.3 對照品貯備溶液 取黃芩苷9.80 mg、綠原酸12.60 mg和梔子苷15.60 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇適量,震搖使溶解并定容。

1.4 供試品溶液 稱取茵梔解毒顆粒約1 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,加入50%甲醇溶液約15 mL,超聲約20 min,用50%甲醇溶液定容。

1.5 色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相:0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序見表1;進樣量10 μL,柱溫30 ℃,流速為1.0 mL/min,用二極管陣列檢測器進行掃描,掃描范圍為210 nm～400 nm,記錄230 nm波長處的色譜圖。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.6 方法學考察

1.6.1 線性范圍 取對照品貯備溶液用50%甲醇溶液分別稀釋2倍、5倍、10倍、20倍和50倍,作為線性實驗溶液,取10 μL進樣,記錄色譜圖和峰面積,以峰面積對濃度作圖,繪制標準曲線。

1.6.2 精密度和穩定性試驗 按照建立的方法測定同一份樣品6次(批號為20210822),計算批內相對標準偏差,作為精密度試驗;取精密度試驗的樣品溶液于間隔2 h、2 h、2 h、6 h和12 h測定其含量,每次測定3次,取平均值,計算批內相對標準偏差,作為溶液穩定性試驗。

1.6.3 方法專屬性 取茵梔解毒顆粒樣品3份,每份各1 g,置于25 mL量瓶中,分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過氧化氫溶液,各1 mL,搖勻,放置1 h[6],進行酸、堿和氧化破壞,加入50%甲醇溶液15 mL,超聲20 min,50%甲醇溶液定容,依法測定。

1.6.4 加樣回收率試驗 根據前期試驗分析,3種藥物的含量均約為1 mg/g。因此,加樣回收率的添加濃度定為1 mg/g。在準確測定本底的情況下(測定6次,取平均值),開展加樣回收率試驗。取3種對照品加甲醇配制成每毫升各約含1 mg的溶液。另取樣品6份,各1 g,精密稱定,置25 mL量瓶中,分別加入相應對照品溶液各1.00 mL,按照建立的方法檢測,結果減去相應本底,計算平均回收率和批內相對標準偏差。

1.6.5 實際樣品的測定 取3批次供試品,每批次各3個平行,取每份樣品各1 g,按照1.4項配制供試品溶液,依法檢測,計算平均含量。

1.7 提取溶劑的選擇 本試驗設計時考慮到提取目標藥物的性質,選擇水、甲醇和50%甲醇超聲20 min以及水、甲醇和50%甲醇水浴回流20 min等方式提取藥物中有效成分,另外參考文獻[5]采用熱水加甲醇提取20 min。

2 結果與分析

2.1 系統適用性試驗 在1.5色譜條件下,對照品溶液和實際樣品圖譜中綠原酸、梔子苷和黃芩苷峰型對稱,對稱因子均在0.95至1.05之間,3種藥物和其邊上的峰,兩者之間的分離度均大于1.5,理論板數以3種藥物計均大于3000,系統適用性試驗各項指標符合要求,典型色譜圖和光譜圖見圖1-圖8。

注:出峰順序為綠原酸、梔子苷和黃芩苷Note: The order of peaks is chlorogenic acid, gardenia glucoside and baicalin圖1 綠原酸、梔子苷和黃芩苷對照品溶液色譜圖Fig 1 Chromatogram of chlorogenic acid, gardenia glucoside and baicalin control solution

圖2 綠原酸對照品溶液光譜圖Fig 2 Spectrum of chlorogenic acid control solution

圖3 梔子苷對照品溶液光譜圖Fig 3 Spectrum of Gardenia jasminoides control solution

注:出峰順序為綠原酸、梔子苷和黃芩苷Note:The order of peaks is chlorogenic acid, gardenia glucoside and baicalin圖4 黃芩苷對照品溶液光譜圖Fig 4 Spectrum of baicalin control solution

圖5 茵梔解毒顆粒色譜圖Fig 5 Chromatogram of Gardenia jasminoides

圖6 茵梔解毒顆粒中梔子苷光譜圖Fig 6 Spectrum of gardenia glycosides in gardenia antidote granules

圖7 茵梔解毒顆粒中黃芩苷光譜圖Fig 7 Spectrum of baicalin in Yinjian Jiexing granules

圖8 茵梔解毒顆粒中綠原酸光譜圖Fig 8 Spectrum of chlorogenic acid in Gardenia jasminoides pellets

2.2 標準曲線的繪制 根據1.2、1.3和1.6.1數據以及方法配制標準曲線線性溶液,依法測定,繪制標準曲線,見圖9。結果梔子苷在3.110～155.5 μg/mL濃度范圍內線性良好,線性方程為Y=3.7946X-1.4586,相關系數r=0.999 9;黃芩苷在1.897～94.86 μg/mL濃度范圍內線性良好,線性方程為Y=17.222X+5.4359,相關系數r=0.999 9;綠原酸在2.478～123.9 μg/mL濃度范圍內線性良好,線性方程為Y=6.255X+1.3125,相關系數r=0.999 7。

圖9 3種藥物標準曲線圖Fig 9 Standard curve for three drugs

2.3 精密度試驗結果 按1.6.2方法測定,結果梔子苷、黃芩苷、綠原酸精密度分別為0.9%、0.7%和0.9%,表明方法精密度良好,結果見表2。

表2 精密度試驗結果(n=6)Tab 2 Precision test results (n=6)

2.4 穩定性試驗結果 取精密度試驗的樣品溶液于間隔2 h、2 h、2 h、6 h和12 h測定其含量,計算批內相對標準偏差,作為溶液穩定性試驗。梔子苷、黃芩苷和綠原酸溶液峰面積的RSD分別為1.2%、1.1%和1.4%,表明溶液穩定性良好,結果見表3。

表3 穩定性試驗結果(n=3)Tab 3 Stability test results (n=3)

2.5 專屬性結果 按1.6.3方法測定,結果顯示,在鹽酸溶液和過氧化氫溶液中這3種藥物均能保持穩定,峰面積減少小于3%;氫氧化鈉溶液中,黃芩苷和梔子苷均減少50%以上,綠原酸幾乎降解100%。

2.6 加樣回收率試驗結果 根據設計的試驗方法開展加樣回收率試驗,3種藥物的平均加樣回收率均在95%以上,6份樣品批內相對標準偏差均在4%以內,表明方法可靠性較好,結果見表4。

表4 平均加樣回收率試驗結果(n=6)Tab 4 Results of mean spiked recovery tests (n=6)

2.7 實際樣品測定結果 依法測定,結果3批次樣品梔子苷的含量范圍為1.57 mg/g～1.60 mg/g之間;黃芩苷的含量范圍為1.11 mg/g～1.16 mg/g之間;綠原酸的含量范圍為0.81 mg/g～0.82 mg/g之間?！东F藥質量標準(2017年版)中藥卷》規定,茵梔解毒顆粒中綠原酸的含量限量為每1 g不得少于0.35 mg,表明該企業生產的3批次樣品綠原酸的含量均符合標準。因梔子苷和黃芩苷沒有相關限量標準,待收集足夠數據以后作為制定標準限量的參考,結果見表5。

表5 實際樣品含量測定結果(n=3)Tab 5 Results of actual sample content determination (n=3)

2.8 提取溶劑選擇的結果 根據設計的試驗方法,對7種提取溶劑進行了考察,結果綠原酸在甲醇中的提取效率較低,黃芩苷在水超聲和水回流中的提取效率較低,梔子苷在甲醇超聲和水回流的情況下結果含量較低,見圖10, 圖中序號1～7分別對應7種提取溶劑及相應的提取方式。綜合分析,本試驗選擇50%甲醇超聲20 min,作為樣品的提取方式。

2.9 定量限 根據1.6.1方法配制稀釋50倍的溶液,為標準曲線的最低點濃度,依法測定,計算3種藥物的信噪比。結果該濃度下3種藥物的信噪比均大于10,滿足含量檢測分析要求的最小濃度,把此濃度對應樣品中藥物的含量,作為相應藥物的定量限。此時,梔子苷的濃度為3.110 μg/mL,黃芩苷的濃度為1.897 μg/mL,綠原酸的濃度為2.478 μg/mL;根據1.4供試品溶液的配制方法,折算到實際樣品中,3種藥物的定量限,分別為梔子苷0.08 mg/g、黃芩苷0.05 mg/g和綠原酸0.06 mg/g。

3 討論與結論

3.1 檢測波長的選擇 本試驗在查閱相關文獻的基礎上,基本了解藥物的性質,3種藥物的紫外吸收明顯,能夠采用液相色譜法對其進行檢測。因此,我們選擇在210 nm～400 nm范圍內對3種藥物進行掃描,以確定3種藥物的最佳檢測波長。圖2～圖4結果顯示,梔子苷的最大吸收波長在240 nm附近,黃芩苷的最大吸收波長在215 nm～277 nm范圍內,綠原酸的最大吸收在210 nm～240 nm范圍內。綜合考慮3種藥物的含量和吸收值,選擇3種藥物均有較大吸收值的波長,使3種藥物能用同一波長同時檢測。因此本試驗選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 本試驗考察了磷酸溶液(0.01%、0.05%、0.2%和0.4%)作為流動相的情況,不同濃度磷酸溶液,對3種藥物的保留時間和峰型的影響不大,而0.4%和0.2%磷酸溶液濃度較高,pH值小于2.0,對C18色譜柱有不利影響。選擇pH值為2.3左右的0.05%磷酸溶液和乙腈配比作為流動相。實際樣品檢測中,因樣品中含有其他藥物或者雜質,易影響藥物和其他組分的分離度,調節梯度洗脫程序,3種藥物峰型對稱、分離度滿足要求。

3.3 結論 試驗建立了高效液相色譜法測定畜禽用中獸藥茵梔解毒顆粒中梔子苷、黃芩苷和綠原酸的方法,采用50%甲醇作為提取溶劑,超聲波清洗器超聲20 min作為提取方式,230 nm作為檢測波長,3種藥物加樣回收率均達到95%以上,試驗操作簡便、快捷,定性定量準確,能滿足中獸藥茵梔解毒顆粒的梔子苷、黃芩苷和綠原酸等3種有效成分的同時檢測。