超高效液相色譜-串聯質譜法檢測牛可食性組織中氟佐隆殘留

王亦琳,葉 妮,尹 暉,陳超超,王鶴佳,孫 雷

(中國獸醫藥品監察所,北京 100081)

氟佐隆(Fluazuron, 化學式C20H10Cl2F5N3O3,CAS:86811-58-7)又稱啶蜱脲,氟啶蜱脲或吡蟲隆,屬于苯甲酰脲衍生物,是一種昆蟲發育抑制劑[1]。其在水中的溶解度小于0.02 mg/L,是一種親脂性物質[2],化學結構式見圖1。氟佐隆曾經作為農藥殺蟲劑廣泛應用于水果、蔬菜等種植行業[3-4]。在畜牧業,氟佐隆是一種新型的抗寄生蟲藥[5-6],主要用于反芻動物,作為蜱、螨、壁虱等外寄生蟲的殺蟲藥。氟佐隆的作用原理是能抑制組成昆蟲表皮的主要成份幾丁質的合成,通過抑制昆蟲蛻皮和新表皮的形成,延緩其發育;或使昆蟲表皮缺乏硬度,導致幼蟲死亡或形成畸形蛹而死亡[7]。研究發現通過皮下注射單劑量給與奶牛氟佐隆后,氟佐隆在脂肪中的分布遠高于肌肉、腎臟和肝臟[8-9]。氟佐隆在牛體內代謝較少,組織和糞便中的未代謝的原型藥物占總殘留量的90%[7]。氟佐隆主要的消除途徑是經糞便排泄,其次是通過腎臟排泄,還有少量通過膽汁排泄。為防止在畜牧生產中濫用氟佐隆,造成相關動物性食品中氟佐隆的殘留,危害人類健康,我國2019年發布的《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650-2019)[10]中規定了氟佐隆的最大殘留限量(MRL):在牛肌肉中為200 μg/kg,在牛脂肪中為7000 μg/kg,在牛肝臟和牛腎臟中均為500 μg/kg。

圖1 氟佐隆化學結構式Fig 1 Chemical structure of fluazuron

目前國內外已經報道的氟佐隆的檢測分析方法主要有氣相色譜法[11],液相色譜法[12-14]和液相色譜-串聯質譜法[15-17],但這些方法有的樣品前處理過程比較繁瑣,有的方法靈敏度不高,還有的分析基質為蔬菜等植物性食品,不能滿足動物可食性組織中氟佐隆殘留檢測的實際需求。本文建立的超高效液相色譜-串聯質譜法操作步驟簡單,靈敏度高,重復性好,可以滿足牛可食性組織中氟佐隆殘留檢測的要求,將對保障動物性食品安全,保證我國畜牧養殖業持續健康地發展發揮積極的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu 30A超高效液相色譜儀-美國AB SCIEX公司QTrap 6500質譜儀(配電噴霧離子源); AE260電子天平,Mettler Toledo公司; Biofuge Strators高速冷凍離心機,賀利氏公司; SIR4渦旋混合器,IKA公司;固相萃取裝置,Waters公司。

1.2 藥品和試劑 氟佐隆對照品(C20H10Cl2F5N3O3,CAS:86811-58-7),品牌Bepure,購自北京振翔科技有限公司,含量99.5%。甲酸(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純),美國Fisher公司;Captiva EMR-Lipid固相萃取柱:300 mg/3 mL,美國Agilent公司;所用水為超純水。

1.3 標準溶液配制 精密稱取氟佐隆對照品約10 mg,置于10 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的氟佐隆標準儲備液。精密吸取1 mg/mL的氟佐隆標準儲備液100 μL于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋成濃度為10 μg/mL的氟佐隆標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的提取 稱取試料各2±0.02 g于50 mL離心管中,加90%乙腈水溶液10 mL,加入一個陶瓷均質子,渦旋1 min,8000 r/ min離心5 min,得上清液備用。

1.4.2 樣品的凈化 取3 mL備用液過captiva EMR-Lipid小柱,擠干,收集流出液,過0.22 μm尼龍微孔濾膜,供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,粒徑1.7 μm),流動相A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫:0～0.2 min保持30% B;0.2～3 min,30% B線性變化到95% B;3～4 min 保持95% B;4～4.1 min 95% B線性變化到30% B;4.1～5.5 min 保持30% B。流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。

1.5.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI+);電噴霧電壓為5500V;離子源溫度為500 ℃;輔助氣1為55 psi;輔助氣2為55 psi;氣簾氣為30 psi;碰撞氣為Medium;檢測方式為多反應監測模式(MRM)。氟佐隆定性、定量離子對及對應的去簇電壓、碰撞能量見表1。

表1 氟佐隆MRM參數Tab 1 Mass parameters of fluazuron

1.6 基質匹配標準曲線的制備 精密量取氟佐隆標準工作液適量,用空白試料經1.4提取凈化后的流出液稀釋成含藥物濃度分別為1、2、5、10、40、80和100 ng/mL(相當于5、10、25、50、200、400和500 μg/kg添加濃度,針對牛肌肉)以及1、2、10、50、100、200和500 ng/mL(相當于5、10、50、250、500、1000和2500 μg/kg添加濃度,針對牛肝臟、腎臟和脂肪)的系列基質匹配標準工作液,過微孔濾膜后由低濃度到高濃度依次上機測定。以氟佐隆的特征離子質量色譜峰面積為縱坐標,氟佐隆基質匹配標準溶液濃度為橫坐標,繪制標準曲線,并計算回歸方程及相關系數。

1.7 方法靈敏度確定 添加適量濃度的氟佐隆標準工作液于2 g空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中,經前處理后測定,觀察藥物特征離子質量色譜峰信噪比(S/N) 和對應藥物濃度,以 S/N>3(按PtP算)作為方法的檢測限,以 S/N>10作為方法的定量限。

1.8 方法準確度及精密度的測定 采用標準添加法,在空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中添加定量限、MRL、2MRL三個濃度的氟佐隆標準工作液。在牛肌肉中的添加濃度為10、200、400 μg/kg;在牛肝臟和腎臟中的添加濃度為10、500、1000 μg/kg;在牛脂肪中的藥物濃度為10、7000、14000 μg/kg。(由于牛脂肪的后兩個添加濃度較高,為了保護質譜儀,避免樣品過載污染儀器和后續樣品,對MRL和2MRL這兩個添加濃度點的脂肪樣品進行稀釋處理:樣品按1.4項前處理后,將收集的流出液用空白脂肪樣品經前處理得到的流出液稀釋10倍后過濾,上機測定)每種濃度5個樣品平行試驗,重復3次,按照1.4項樣品前處理方法處理之后上機測定,基質匹配標準溶液外標法定量,計算回收率、批內、批間變異系數。

1.9 基質效應的考察 取空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪樣品,按1.4項進行樣品前處理,用空白樣品流出液配制成氟佐隆濃度為:牛肌肉2、40、80 ng/mL,牛肝臟和腎臟2、100、200 ng/mL,牛脂肪2、140、280 ng/mL的氟佐隆標準溶液,作為空白基質匹配標準溶液,每個濃度6份。用初始流動相配制成氟佐隆濃度分別與上述濃度相對應的標準工作液,作為基質效應考察的參照溶液。對上述樣品進樣分析,記錄氟佐隆的峰面積并計算基質效應。

基質效應計算公式:基質效應%=基質匹配標準溶液的峰面積/參照溶液的峰面積×100%。

2 結果與分析

2.1 基質匹配標準曲線 以氟佐隆的特征離子質量色譜峰面積與其對應的基質匹配標準溶液濃度作圖,得到相應的標準曲線,線性回歸方程及決定系數(R2)見表2。氟佐隆在牛肌肉1～100 ng/mL的的基質匹配標準溶液濃度范圍內;在牛肝臟、腎臟和脂肪1～500 ng/mL的基質匹配標準溶液濃度范圍內,特征離子質量色譜峰面積與濃度均呈良好的線性關系,R2均>0.990。

表2 氟佐隆標準曲線的回歸方程和決定系數Tab 2 Regression equations and coefficient of determination of fluazuron

2.2 方法靈敏度 按1.7項中所述方法進行處理,依據氟佐隆特征離子質量色譜峰信噪比S/N>3和S/N>10分別為方法的檢測限和定量限,得出在空白牛肝臟、腎臟、肌肉和脂肪中,氟佐隆的檢測限均為5 μg/kg,定量限均為10 μg/kg,特征離子質量色譜圖見圖2。

1. 牛肌肉;2. 牛肝臟;3. 牛腎臟;4. 牛脂肪1. Cattle muscle;2. Cattle liver;3. Cattle kidney;4. Cattle fat圖2 10 μg/kg空白牛可食性組織添加樣品中氟佐隆藥物特征離子質量色譜圖Fig 2 Characteristic ion mass chromatogram of fluazuron 10 μg/kg added in blank cattle edible tissues

2.3 方法準確度及精密度 在空白牛肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中各添加3個不同濃度的氟佐隆標準工作液進行回收率試驗,結果匯總見表3。試驗結果表明,氟佐隆在牛肌肉10～400 μg/kg、牛肝臟和牛腎臟10～1000 μg/kg、牛脂肪10～14000 μg/kg空白添加濃度范圍內的回收率為72.0%～98.6%;批內與批間RSD均小于15%。結果表明本方法定量準確,重復性好。

表3 空白牛可食性組織中氟佐隆添加的回收率(n=5)Tab 3 Recoveries of fluazuron in blank cattle edible tissues

2.4 基質效應考察結果 按1.9項所述方法進行基質效應考察,結果匯總見表4。從考察結果可以看出本分析方法的基質效應較微弱,但考慮到實際樣品檢測時可能會處理來源較為復雜的樣品,基質效應可能會有變化。因此,在定量方法選擇時仍然采用了基質匹配標準溶液法進行定量,消除可能存在的基質效應帶來的影響,提高定量的準確性。

3 討論與小結

3.1 提取方法的選擇 由于氟佐隆不溶于水,目前已報道的文獻中多采用純乙腈[3,13]或正己烷[15]等有機溶劑作為氟佐隆的提取溶劑。考慮到乙腈和正己烷等有機溶劑具有一定的毒性,且本方法的分析樣品為牛肉等生物樣品,在加入純有機溶劑渦旋提取時樣品容易成團,影響提取效率。經過比較,選用了5倍稱樣體積的90%乙腈水溶液作為提取溶劑,渦旋提取一次,能有效提取樣品中的氟佐隆藥物殘留。為防止加入提取液之后樣品結塊,本方法在每個樣品管中加入一個帶有切面的陶瓷勻質子,在渦旋提取操作時可以有效防止樣品結塊成團,提高了提取效率。

3.2 凈化方法的選擇 在關于動物可食性組織中氟佐隆殘留檢測的文獻中,有報道采用Florisil 固相萃取小柱[8]和中性氧化鋁小柱[15]凈化處理樣品。由于氟佐隆的酸度系數(pKa)為8.61±0.46,偏堿性,試驗中曾選擇了Oasis MCX小柱和Bond Elut Plexa PCX小柱進行凈化效果的考察。結果發現MCX與PCX柱的樣品前處理過程操作復雜,處理樣品耗時較長,與文獻報道的凈化方法相比并無明顯優勢。本試驗最終選擇了EMR-Lipid柱進行樣品的凈化。提取液經高速離心后直接上樣于EMR-Lipid小柱,收集樣品流出液后直接過濾膜上機測定。整個凈化步驟相比文獻報道的凈化方法操作簡單,無需將固相萃取小柱預先活化,也省略了氮氣吹干樣品和樣品復溶等步驟。從得到的譜圖和回收率數據中可以看出,該方法在有效去除基質干擾的同時,樣品回收率較高,可以滿足氟佐隆殘留檢測的要求。

3.3 濾膜材質的考察 試驗初期發現使用PTFE材質的濾膜,藥物吸附嚴重,可以使藥物響應值下降約2個數量級。通過比較PTFE、PES、GHP和尼龍等多種材質的濾膜,最終確定了尼龍材質的濾膜基本無藥物吸附,最終選擇0.22 μm的尼龍膜過濾樣品。

目前國內外尚未檢索到檢測牛可食性組織中氟佐隆殘留的超高效液相色譜-串聯質譜分析方法,本方法的建立填補了國內外相關領域的空白。該方法快速、便捷,具有良好的可操作性和重現性,方法靈敏度、準確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求,具有良好的應用前景。