吉林省長春市城鄉活禽市場H9N2亞型禽流感病毒的檢測與分子遺傳進化分析

任永寧,劉新鑫,閆巍文,姜姍姍,汪思捷,沙雨欣,王夢君,徐小洪,丁 壯,高 超,尹仁福

(吉林大學動物醫學學院預防獸醫學系人獸共患病研究教育部重點實驗室,人畜共患傳染病重癥診治全國重點實驗室,長春 130062)

H9N2亞型AIV自1992年首次在我國檢測到[1],如今已廣泛分布在全國。現有數據顯示我國H9N2已經取代H5和H7亞型,成為AIV中優勢亞型[2-3]。研究證明H9N2亞型AIV可為新型重組的H5N1、H5N6、H5N2和H7N9等高致病性流感病毒提供基因片段,為其變異提供材料[4-5]。且近些年來,人感染H9N2禽流感的病例也愈發增多。因此,定期開展AIV的流行病學調查不可或缺。本研究在長春市周邊活禽市場展開調查,對鑒定為陽性的樣本進行全基因組測序及系統發育分析,為當前國內H9N2亞型AIV的流行病學研究提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源與雞胚 本實驗所涉及的樣本收集來自2021年9月至2023年4月在長春市周邊城鄉活禽市場,共計170份。SPF雞胚購于濟南賽斯家禽科技有限公司,由本實驗自行孵化至10日齡胚。

1.1.2 主要試劑 Trizol LS Reagent購自Sigma公司;6×loading buffer、DL2000 Marker購自北京聚合美生物科技有限公司;NovoScript?One-Step RT-PCR Kit一步法RT-PCR試劑盒購自蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 待檢測樣品取上清液接種至10日齡SPF雞胚,置于37 ℃培養箱中觀察,72 h后收集雞胚尿囊液。經HA-HI檢測后對無血凝性的樣品盲傳2代,如仍未有血凝效價則認為AIV陰性。通過血凝抑制實驗確定分離的病毒亞型以及混合感染。血凝陽性樣本總RNA提取按照制造商的建議用Trizol Reagent 分離。使用NovoScript?One-Step RT-PCR Kit 一步法RT - PCR試劑盒鑒定AIV。結果為陽性按照有限稀釋法純化病毒并進行全基因組測序。全基因組擴增引物信息參考霍夫曼引物[6]。對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,將陽性條帶送至生工生物工程(上海) 股份有限公司測序。

1.2.2 序列比對與遺傳進化分析 使用Lasergene11軟件進行序列拼接及同源性分析,利用NetNGlyc 1.0預測3株分離株的HA和NA基因糖基化位點。在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)及全球流感基因共享數據庫(Global Initiative on Sharing All Influenza Data, GISAID)中下載參考毒株,使用MEGA 7軟件設置鄰接法(Neighbor-joining, NJ, Bootstrap=1000)進行多序列比對,對各基因片段繪制遺傳發生樹。

2 結 果

2.1 樣品的檢測與病毒的分離鑒定 本實驗所涉及的樣本收集于長春市周邊城鄉活禽市場共計170份,鑒定為AIV的26份,其中選取3株具有代表性H9N2毒株使用有限稀釋法連傳三代純化后進行全基因組測序。三株AIV序列已上傳至GENEBANK,序列號為OR230154至OR230177。將其分別命名為A/chicken/Jilin/HL45/2022、A/pigeon/Jilin/HL55/2022、A/pigeon/Jilin/HL56/2022簡稱(CK/JL/45/22、PGN/JL/55/22、PGN/JL/56/22))并進行后續研究。

2.2 HA基因序列及關鍵氨基酸位點分析 3株H9N2亞型分離株均來自于長春市活禽市場,HA基因ORF全長均為1683 bp,編碼560個氨基酸。其中HA的蛋白裂解位點為PSKSSR↓GLF,屬于不連續堿性氨基酸序列,未發現連續多堿性氨基酸的插入,符合LPAIV特征。分離株之間HA基因核苷酸同源性為99.7%～99.9%。與經典毒株對比后,發現3株分離株與A/Chicken/HongKong/G9/1997的同源性最高為 87.3%～87.6%。對3株分離株HA基因受體結合位點進行分析如表1所示,發現Q226L位點、Q227M(H3編號)發生突變,Q226L位點突變更傾向于結合α, 2-6唾液酸受體,導致親嗜性由禽類轉變為哺乳動物。此外,分析發現3株分離株381位氨基酸位點存在E381K突變,先前研究表明此為一個有利于AIV氣溶膠傳播的關鍵位點[7]。對3株分離株HA蛋白的糖基化位點進行分析發現,3株分離株的HA蛋白具有8個潛在糖基化位點,在29-31、82-84、141-143、298-300、305-307、313-315、492-494、551-553位出現潛在糖基化位點。分離株在313位增加了一個糖基化位點,這會導致病毒介導的細胞融合和受體結合能力增強[8]。HA基因系統發育樹分析如圖1所示,3株分離株HA基因均屬于BJ-94 like分支。與廈門人流感A/Fujiansiming/19/2021基因高度同源,在進化樹屬同一分支。

圖1 HA、NA基因系統發育樹Fig 1 The phylogenetic tree based on genes of HA and NA

表1 H9N2亞型AIV分離株HA關鍵氨基酸位點分析及潛在糖基化位點分析Tab 1 Analysis of key amino acid sites and potential glycosylation sites in HA of H9N2 subtype AIV isolates

2.3 NA基因序列及關鍵氨基酸位點分析 3株H9N2分離株NA基因ORF全長均為1463 bp,編碼466個氨基酸。3株分離株核苷酸同源性為99.6%～99.9%。與經典毒株氨基酸比對分析如表2所示,發現3株分離株在NA莖部62-64位都缺少三個氨基酸,這表明毒株對小鼠的毒力可能增強[9]。在紅細胞吸附位點上存在K68 N、D369S突變,而在431-433位及活性中心位均未發現突變現象。在氨基酸N70S位點發生突變,該位點突變可以產生對扎納米韋的耐藥性[10],而在119、274、292位中沒有出現對達菲有耐藥性的突變位點。3株H9N2分離株NA蛋白糖基化位點如表2所示,其均存在44、66、83、143、197、231、365、399位的糖基化位點。3株H9N2分離株的NA基因均屬于Y280-like分支,其基因系統發育樹分析如圖1所示。

2.4 內部基因序列及關鍵氨基酸位點分析 對3株H9N2 亞型AIV毒株內部核苷酸同源性基因進行分析,各基因節段同源性為: PB2:99.7%～99.8%、PB1:99.5%～99.8%、PA:99.5%～99.7%、NP:98.9%～99.3%、M:95.0%～96.2%、NS:97.6%～98.6%。3株H9N2分離株的PB2、M基因均屬于G1譜系;PB1、PA、NP、NS均屬于F-98譜系,其內部6個基因系統發育樹分析如圖2所示。對3株H9N2分離株的PB2蛋白關鍵氨基酸進行分析,發現在E627K、D701 N均未發生突變。而在V147I、A184T、I292V、R389K、A588V、T598I、L648V和T676M位點均存在突變。其中V147I突變會增加小鼠致病性、A588V突變提高了病毒在宿主體內的適應性并使其獲得了在哺乳動物間的傳播能力[11]。此外,對PB1蛋白關鍵氨基酸的分析發現PB1上發生了能增強AIV在雪貂中傳播能力的I368V突變[12]。此前有研究表明PA蛋白672L是影響H9N2亞型AIV氣溶膠傳播特性的關鍵氨基酸位點[7],本研究3株毒株PB1蛋白第672位點均不為L。M基因編碼M1和M2蛋白,在M1上第231位沒有發生與大鼠適應性相關的D231 N突變,而在M2基因片段中發現S31 N點突變,該位點突變使得病毒對金剛烷胺類藥物產生耐藥性[13]。NS基因編碼NS1蛋白和NS2蛋白,其中NS1蛋白的第42位發生P42S的突變,這導致AIV對哺乳動物的致病性增強[14]。NS1 V149A突變后,則能夠使病毒在雞體內復制,從而影響病毒對雞的致病性[15]。

圖2 PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因系統發育樹Fig 2 The phylogenetic tree based on genes of PB2, PB1, PA, NP, M and NS

3 討 論

H9N2亞型AIV作為全球廣泛流行的AIV之一,其對世界養殖業的危害日益增加,這也是相關從業者亟待解決的問題之一。本研究于2021年9月至2023年4月長春市周邊城鄉活禽市場采樣檢測并分離鑒定3株H9N2亞型AIV并進行全基因組測序。補充了國內該亞型AIV毒株的生物學信息,同時對其分子生物學特性展開分析。經對其核苷酸序列分析,發現在3株分離株出現HA-Q226L,這表明分離株更傾向于結合α,2-6唾液酸受體結合,導致親嗜性由禽類轉變為哺乳動物。3株分離株HA基因均屬于BJ-94 like分支,與廈門人流感A/Fujiansiming/19/2021基因高度同源,在進化樹屬同一亞分支[16]。這表明我國當前AIV傳播迅速,傳播范圍廣泛。家禽業的從業者要加強防護措施。分子遺傳進化分析顯示3株毒株的HA基因歸屬于BJ-94譜系中h9.4.2.5亞分支;NA基因歸屬Y280譜系;PB2、M基因均屬于G1譜系;剩余內部基因均屬于F-98譜系,這表明本文中分離3株H9N2亞型AIV均屬于G57基因型[17]。有研究表明,自2013年以來,G57基因型AIV病毒為我國主要流行毒株[18]。3株分離株在NA莖部62-64位都缺少三個氨基酸,已經被推測為這種缺失模式的短莖NA可能是水禽傳播到陸生家禽,并對其逐漸產生適應性的一個重要分子標記[19]。PB2 588位點作為PB2-F6 組合突變的關鍵共適應位點,在鳥類和哺乳動物中獲得了比PB2 588位點單突變更高的AIV適應性,這表明PB2 588位點與其他突變位點的協同作用可以進一步增強這種共適應性,共同適應的出現不僅增加了對鳥類和哺乳動物的威脅,而且還可能導致鳥類之間的大流行,并跨越哺乳動物的種間障礙[20]。在針對耐藥性方面發現在NA在氨基酸N70S位點發生突變,該位點突變可以產生對扎納米韋的耐藥性[10],而在119、274、292位中沒有出現對達菲有耐藥性的突變位點。在M2基因片段中發現S31 N點突變,該位點突變使得病毒對金剛烷胺類藥物的產生耐藥性,而在L26F、V27A、A30V/T/S和G34E位點均未出現耐藥性突變位點。

H9N2亞型AIV如今已被認為是AIV基因的主要供體,通過重組共循環的流感病毒可導致人畜共患重組[21]。自2013年以來, AIV已在中國造成5次連續人間流行。蒲娟等[22]發現H9N2在第五次大流行前發生了包含哺乳動物適應性突變的PB2和PA基因的新的H9N2病毒亞分支被重組為共循環的H7N9病毒,形成了一種新的顯性H7N9病毒基因型。過去的研究表明活禽市場是人感染禽流感的傳播源甚至是潛在的孵化器。本次實驗結果表明在城鄉結合地區中仍能檢測出H9N2亞型AIV,且和不經適應直接感染人的禽流感毒株高度同源。因此,應在已有成績之上繼續完善一體化的防控機制,加強城鄉結合地區的監管力度,實現人病獸防,關口前移、在人與動物間切斷傳染源,以降低人類感染AIV的風險。