仔豬病毒性腹瀉病原檢測與分析

●苑 彬

（河北省廊坊市安次區農業農村局 河北 廊坊 065000）

經國內外相關研究表明，引起不同日齡仔豬腹瀉因素很多，如病原因素（病毒、細菌和寄生蟲），養殖場環境因素（溫度、濕度、采光），飼養管理技術因素（飲水、飼料）及外界環境應激（斷奶、轉群、換料）等。仔豬病毒性腹瀉可引起仔豬的生長性能下降、免疫力降低、腹瀉、腸道感染等一系列的臨床癥狀，嚴重時可導致其死亡，給我國生豬養殖業造成嚴重的經濟損失[1-2]。臨床中常見的引起仔豬病毒性腹瀉的病原有PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種，可引起仔豬病毒性腹瀉以厭食、嘔吐、水樣腹瀉及嚴重脫水，傳染性強、死亡率較高，采用實驗室診斷方法可進行鑒別診斷，如病理學觀察、免疫學診斷及分子生物學診斷[3-5]。病毒性腹瀉對仔豬的危害較大，因此，采用實驗室診斷方法（RT-PCR）對仔豬病毒性腹瀉病毒的區別診斷具有重要意義。

2020～2022年在河北廊坊安次區仔豬規模化養殖場及散養戶采集患腹瀉病仔豬糞便、腸內容物及內臟病料組織總計1508份，進行PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病毒性腹瀉病原檢測，并開展4種病毒性腹瀉病流行病學調查，對該地區仔豬4種病毒性腹瀉病綜合防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2020～2022年采集河北廊坊安次區規模化養殖場及散養戶患腹瀉病仔豬糞便、腸內容物及其他內臟病料組織1508份，其中2020年采集病料樣品461份、2021年采集病料樣品494份，2022年采集病料樣品553份（表1）。

表1 樣品采集統計結果

1.2 試驗方法

1.2.1 病料的處理與核酸的提取 將采集的病料加入等量、無菌的PBS進行研磨，高速離心（12 000 r/min，10 min），取上清分裝，-80℃反復凍融3次。參照組織RNA提取試劑盒，提取病料組織中病毒RNA，反轉錄為cDNA，-80℃保存備用。

1.2.2 引物設計與RT-PCR檢測 參照文獻[6]報道的PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原鑒定引物（表2），在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以本文“1·2”節中反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR產物經1·0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測判定其結果，并分析其感染率。

表2 引物序列

2 結果與分析

2.1 仔豬4種病毒性病原的檢測結果

對2020～2022年采集河北廊坊安次區區仔豬規模化養殖場及散養戶中患腹瀉仔豬糞便、腸內容物及其他內臟病料組織總計1508份樣品進行處理，并提取組織RNA，反轉錄成cDNA，用RT-PCR方法檢測PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原，結果見圖1。用RT-PCR方法對采集的樣品可擴增出PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原目的基因條帶（231 bp，342 bp，309 bp，1100 bp），與預期大小一致。

圖1 仔豬樣品中的PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV PCR檢測結果

2.2 仔豬4種病毒性病原的陽性率檢測結果

2020～2022年采集的1508份樣品，包括2020年采集病料樣品461份、2021年采集組織樣品494份，2022年采集組織樣品553份，對采集的樣品采用RT-PCR方法檢測PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原，分析4種病原陽性率，統計感染情況。由表3可知，2020～2022年共計采集1508份樣品，檢測的PEDV、TGEV、PorV和PDCoV陽性率分別為11·00%，7·03%，2·98%，2·59%，其中PEDV和TGEV陽性率較高，且呈現逐年上升的趨勢。

表3 不同種類豬感染病原的檢測結果

3 討論與結論

仔豬病毒性腹瀉病是養豬業中常見疾病之一，臨床中常見的病毒性病原主要包括PEDV、TGEV、PorV和PDCoV，仔豬的感染率和死亡率均較高，且在臨床中癥狀相似，不易區分[6]。有研究表明，RT-PCR是檢測仔豬病毒性腹瀉病最有效的檢測方法，該方法便于操作、靈敏度高、假陽性率低，并且適用于規模化養殖場的檢測。本試驗研究表明，用RT-PCR方法對采集的樣品可擴增出PEDV（231 bp）、TGEV（342 bp）、PorV（309 bp）、PDCoV（1100 bp），與預期大小一致；經分析，采集1508份樣品中PEDV、TGEV、PorV和PDCoV陽性率分別為11·00%、7·03%、2·98%和2·59%，其中PEDV和TGEV陽性率較高，且呈現逐年上升的趨勢。說明該地區規模化養殖場及散養戶中PEDV和TGEV流行嚴重，應引起注意，定期進行檢測和對仔豬進行PEDV和TGEV疫苗接種，進行有效的綜合防控。