NH3和H2S降解功能菌的分離鑒定及降解特性研究

江海溶 崔若琪 王玥 白淼 張明露 任連海

（北京工商大學生態環境學院國家環境保護食品鏈污染防治重點實驗室，北京 100048）

2019年起，我國地級及以上城市全面開展垃圾分類工作，其中將廚余垃圾單獨收集成為生活垃圾分類收集的重點工作［1］。廚余垃圾具有含水率高、有機質高、含鹽量高、含油量高和易腐爛等特點，若處理不及時易產生惡臭，并會滋生病原微生物，引發環境污染問題［2-3］。廚余垃圾所產生的惡臭不僅刺激人的嗅覺器官，而且很多組分是有毒有害氣體，對人體及動植物造成危害［4］。惡臭氣體種類有很多，包括：H2S、SO2、NH3、CH4和二惡英等，雖然不同地區產生的廚余垃圾主要成分有所區別，但其中NH3和H2S是較為典型的惡臭氣體［5-6］。

目前對控制惡臭氣體的研究工作主要集中在化學除臭、物理除臭和生物除臭三方面。生物除臭以除臭效率高、無二次污染、操作簡單、成本低廉，成為治理惡臭環境的一個重要研究方向［7］。近年來，研究工作多集中在高效除臭優勢菌株的選育，推廣應用的研究多采用外國進口的微生物制劑，以韓國的鈕咳厲惡、德國的潔博士、日本的EM菌劑為主［8-10］。目前國內選育和復配的微生物除臭劑研究起步較晚，菌株除臭效果相對國外進口的微生物菌劑存在一定的差距［11-12］。

本研究通過多種除臭微生物菌種的篩選，以NH3和H2S的降解率為除臭篩選指標，優選降解效率最高的菌株，確定其最佳培養條件和混合比例，最終混合成微生物除臭劑，應用于廚余垃圾臭氣的降解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 用無菌桶從北京工商大學東區學校食堂收集約1 kg廚余垃圾至化工樓實驗室，用小型破碎機破碎后備用。取10 g廚余垃圾進行實驗使用，剩余樣品在4℃冰箱保存。

1.1.2 培養基 實驗培養基配方如下：

NH3降解菌篩選培養基［13］：蔗糖50.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，1% ZnSO45 mL，NaCl 2.0 g，氨水10.0 mL，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min，氨水過濾除菌后加入；

H2S降解菌篩選培養基［14］：蛋白胨10.0 g，牛肉膏2.0 g，NaCl 5.0 g，Na2S 2.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min；

異養硝化培養基［15］：C6H5Na3O75.0 g，（NH4）2SO40.45 g，K2HPO40.25 g，FeSO40.0025 g，NaCl 0.125 g，MgSO40.06 g，MnSO40.001 g，瓊脂粉15.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH=7.0，121℃滅菌20 min；牛肉膏蛋白胨培養基：稱取牛肉膏蛋白胨培養基33 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 NH3和H2S降解菌的富集與純化 經20 000 r/min離心處理后的廚余垃圾，取100 μL上清液分別接入NH3和H2S選擇性培養基，進行富集馴化［16］。將特征不同的菌落劃線純化至單菌后，分別吸取200 μL菌液于相應的斜面培養基上培養后，保存備用，挑取分離后的菌株接種于相應的液體培養基上，30℃、130 r/min，搖床擴大培養72 h。

1.2.2 NH3和H2S降解菌的初篩 將分離純化獲得的菌株制作成5 mL菌液，接入裝有50 g新鮮廚余垃圾的1 000 mL廣口瓶中，混勻，同時以接種5 mL無菌水的廚余垃圾樣品作為對照，雙層塑料膜密封，置于30℃，130 r/min恒溫搖床中發酵。發酵24 h后采用感官法對惡臭氣體強度進行評定，實驗重復3次，將除臭能力明顯的菌株進行復篩試驗［17］。

1.2.3 NH3和H2S降解菌的復篩 選擇初篩中具有較好除臭效果的菌株進行復篩試驗，以10% 接種量將菌株接種至相應的NH3和H2S降解菌培養基，培養成菌液，置于30℃，130 r/min恒溫搖床中培養48 h。每個菌株做3組平行，同時設置空白對照組。實驗組與空白組進行差異顯著性分析，計算NH3與H2S的降解率，確定NH3與H2S降解率較高的菌株。

1.2.4 最佳NH3和H2S降解菌的篩選 將復篩菌株的菌液接種于對應的培養基中，置于30℃，130 r/min恒溫搖床中培養，設置空白對照組，每個菌株做3組平行。培養24 h后取出菌液，計算出氨氮濃度和硫酸鹽濃度［18-19］，最終得出最佳NH3降解菌株和H2S降解菌株。

1.2.5 菌株的鑒定 采用革蘭氏染色法對分離得到的菌株進行形態學觀察，分子生物學鑒定由北京開泰明鏡基因科技有限公司進行16S rDNA測序鑒定。16S rDNA基因擴增的PCR引物為細菌通用引物，上游引物（341F）5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，下游引物（785R）5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。擴增反應體系為25 μL，其中，上、下游引物各0.25 μL、模板DNA 2 μL，2×Mastermix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。擴增反應條件為95℃使DNA預變性3 min；95℃使DNA變性30 s，55℃引物退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環；最后72℃延伸5 min將PCR產物純化后加入到 Illumina Novaseq 6000 測序平臺進行高通量測序，得到測序結果后通過BLAST程序與NCBI GenBank中核酸數據進行比對分析，查找與各菌株相似性最高的菌株序列［20］。

1.2.6 菌株培養條件優化 將分離得到的兩株細菌分別制作液體培養物，溫度梯度設置為25℃、30℃、35℃、40℃，培養48 h，每隔4 h取樣測量OD600值，根據生長曲線變化情況，選擇最佳培養溫度。在最佳培養溫度下依次設置不同梯度的接種量、pH、C/N、碳源、氮源，130 r/min條件下搖床振蕩培養48 h后測定菌株的降解率，每組試驗做3組平行，最終取平均值（表1）。

表1 除臭條件優化實驗設計Table 1 Experiment design of optimal deodorizing conditions

1.2.7 混合培養對臭氣的降解效果 將獲得的兩株菌株在牛肉膏平板培養基上進行交叉劃線，觀察交叉點是否有菌株生長情況，兩者能生長為不拮抗，一株或兩株都不能生長為拮抗。若兩株菌株不產生拮抗，將其分別制作液體培養物，在最佳培養條件下，混合比例依次設置為1∶1、1∶2、2∶3、3∶2、2∶1，130 r/min的搖床震蕩培養48 h，每隔4 h取出菌液，測量pH變化情況和吸光度，繪制濃度曲線，選擇最佳混合比例。在最佳混合比例下，培養72 h，每隔4 h取樣，檢測氨氮和硫酸鹽離子濃度變化情況，計算氨氮降解率和硫酸鹽生成率。每組試驗做3組平行，最終取平均值。

1.2.8 分析方法 復篩降NH3試驗：硼酸吸收凱氏定氮法［21］；復篩降H2S試驗：鋅銨絡鹽比色法［22］；NH3降解效率的測定：納氏試劑分光光度法［23］；H2S降解效率的測定：采用鉻酸鋇分光光度法［24］。

1.2.9 數據處理 采用 Microsoft Office Excel 2022進行數據處理，Origin Pro 2021bS R2進行作圖。

2 結果

2.1 降解菌株的篩選

利用選擇性培養基共篩選到菌株40株，其中NH3降解菌株中細菌（CN）10株、真菌（PN）5株、乳酸菌（MN）5株，H2S降解菌株中細菌（CS）10株、真菌（PS）5株、乳酸菌（MS）5株。將氣味評判等級4、5的16株菌株去除，剩余24株菌株進入復篩階段。

復篩采用降NH3和降H2S實驗，計算培養液中NH3和H2S含量，與空白中的含量進行對比，最終得出菌種所對應的NH3或H2S的去除效率，選取去除率達到60%以上的菌株進行NH3和H2S的高效降解菌的篩選。根據表2可知，共有8株菌株可進入復篩，其中可降解NH3的編號為：CN5、CN10、PN1、PN3，可降解H2S的編號為：CS2、CS4、CS6、CS7。

表2 篩選結果及其降解率Table 2 Screening results and degradation rates

2.2 最佳NH3和H2S降解菌的篩選及鑒定

由圖1-A可知，最佳NH3降解菌株編號為CN5，24 h后CN5菌液中氨氮含量最低為103.5 mg/L，NH3去除率為83.1%。由圖1-B可知，最佳H2S降解菌株編號為CS2，24 h后CS2菌液中硫酸鹽生成含量最多為304.2 mg/L，H2S去除率為87.2%。如圖2-A所示CN5菌為革蘭氏陽性菌，顯微鏡下呈現璉球狀，菌落大，黃色不透明，邊緣清晰，較濕潤容易挑取，單菌培養時生長速度較慢。如圖2-B所示CS2菌為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下呈現長卵狀，菌落細小，白色通透，邊緣清晰，濕潤容易挑取，單菌培養時生長速度快。對菌株的DNA進行PCR擴增及16S rDNA基因鑒定后，系統發育樹如圖3所示，根據BLAST結果，菌株CN5與Enterococcuss casseliflavus NCIMB 11449的相似性為99%，菌株CS2和Pseudomonas geniculata ATCC 19374的相似性為99.78%，說明分離菌株CN5屬于腸球菌屬（Enterococcus sp.），菌株CS2屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

圖1 菌株對氨氮（A）和硫酸鹽（B）的轉化情況Fig.1 Transformation of ammonia nitrogen（A）and sulfate（B）by strains

圖3 菌株CN5和CS2的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of the CN5 and CS2 strains

2.3 NH3和H2S降解菌培養條件優化

由圖4可知，菌株CN5和CS2的OD600均在35℃溫度下達到最大值，說明35℃條件下菌株生長最旺盛。如圖5-A所示，接種量為10%時菌株對NH3和H2S的降解率最高，分別為83%和86.3%。菌株CN5更適合在堿性條件下生長，在初始pH為7-8.5時，降解效果較好，降解率接近85%；菌株CS2更適合在酸性條件下生長，在初始pH為6-7.5時，降解效果較好，降解率均在85%以上（圖5-B）。以原始培養基中碳源氮源為基底，初始碳氮比為25∶1時，兩株菌株對兩種氣體的降解效果均最佳，降解率可達84.7%和88.9%（圖5-C）。當以蔗糖和氯化銨作為唯一碳源和氮源時，兩菌株均能達到最佳降解效果，NH3降解率均接近85%，H2S降解率均在85%以上（圖5-D，5-E）。綜上兩菌株培養的最優條件：接種量為10%，培養溫度為35℃，初始pH為7，碳氮比25∶1，碳源為蔗糖，氮源為氯化銨。

圖4 菌株在不同溫度培養時的OD600值Fig.4 OD600 value of strains cultured at different temperatures

圖5 菌株CN5和菌株CS2在不同培養條件下降解率的變化Fig.5 Changes in degradation rates of strain CN5 and strain CS2 under different culture conditions

2.4 最佳混合比例的確定

在平板上將菌株交叉十字劃線，兩菌株交叉點生長良好，說明菌株彼此之間沒有拮抗作用，可以進一步進行最佳除臭組合的篩選。由圖6可知，菌株CN5和CS2以2∶3的比例接入時，OD600值最大，菌株生長最旺盛。由圖7可知，菌株CN5和CS2以2:3的比例接入時，pH值在7左右保持穩定。在上述單因素優化條件得出的最佳培養條件下，混合菌劑對NH3的降解率達到86.3%，對H2S的降解率達到91.2%。相較于圖5中單個菌株對NH3和H2S的降解率分別為84.7%和88.9%，兩菌在混合狀態下產生的協同作用，能進一步提高NH3和H2S的降解率。

圖6 兩菌株不同混合比例下OD600的變化Fig.6 Changes of OD600 under different mixing ratios of two strains

圖7 兩菌株不同混合比例下pH的變化Fig.7 Changes of pH under different mixing ratios of two strains

2.5 氨氮含量和硫酸鹽含量測定

通過氨氮含量和硫酸鹽含量測定實驗，進一步確認兩株菌的降解能力，由圖8可知，在0-24 h內，氨氮濃度呈現指數下降趨勢，硫酸鹽濃度呈現指數上升趨勢，兩者變化幅度均較大。在24-72 h，氨氮和硫酸鹽離子濃達到飽和后基本保持不變。最終氨氮濃度穩定在50.5 mg/L，氨氮降解率為85.3%，相較于圖1-A中未優化條件下氨氮降解率83.1%，優化條件下氨氮降解率提高了2.2%。硫酸鹽濃度穩定在302.7 mg/L，硫酸鹽生成率為89.2%，相較于圖1-B中未優化條件下硫酸鹽生成率87.2%，優化條件下硫酸鹽生成率提高了2.0%。

圖8 兩株菌混合條件下氨氮和硫酸鹽離子濃度變化曲線Fig.8 Variation curve of ammonium nitrogen and sulfate ion concentration under mixed conditions of two strains

3 討論

微生物對臭氣的降解率與接種量、pH有密切關系，接種量過低降解效果不明顯，接種量過高導致菌種繁殖過于旺盛產生多余的代謝物質，影響降解效率。本研究中接種量為10%時菌株生長最旺盛，對NH3和H2S的降解率最高。pH值是影響微生物活性的重要因子之一，其值太小或太大都會影響菌劑除臭效果，一般適宜微生物生長的pH值環境是中性左右，本研究中最適宜兩株菌生長的pH為7，與現有研究一致。張紅玉等［25］研究表明碳氮比為25∶1時，是微生物生長繁殖以及分解有機物的最佳條件，能夠保證能量和氮素來源都不會受到限制。本研究中最佳碳氮比為25∶1與現有參考文獻一致，碳氮比過高和過低都不利于細胞生長和外源蛋白表達和積累，過低導致菌體提早自溶；過高導致細菌代謝不平衡，最終不利于產物的積累［26］。蔣敏［27］在對廚余垃圾好氧堆肥高效菌劑的研發中發現葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉均是容易被微生物利用的碳源，其中添加蔗糖作為碳源可在實驗前期加快細胞增殖。本研究中蔗糖為提高NH3和H2S降解率的最佳碳源。同時，氮源也是影響菌劑除臭效果的重要因素，一定的氮源能夠促進微生物菌劑對惡臭氣體的分解，加快反應時間和效率。夏遠艦等［28］對異養硝化-好氧反硝化菌最佳氮源的研究中發現，由于氯化銨中含有可促進菌劑代謝的氨氮離子，因此添加氯化銨作為唯一氮源時菌株作用效果最佳，本研究中最佳氮源也為氯化銨，對NH3和H2S降解率均可達到85%。

在菌株混合培養方面，Van Ransbeeck等［29］研究表明，臭氣成分復雜，每一種臭氣都需要特定的微生物來降解，單一菌株除臭效果低于多種微生物共同作用的效果，兩株菌接種于同一體系中互利共生，聯合作用，可在一定程度上提高生長繁殖能力。史鉆紅等［30］研究表明廚余垃圾的pH一般為中性偏酸性，因此兩株菌混合，偏向于酸性條件的菌株CS2添加相對比例高時，除臭效果更明顯。腸球菌已有多個研究表明具有除臭作用［31-33］，對NH3降解效果可達70%以上，同時對CH4、甲醛、二惡英等惡臭氣體也有一定的降解作用。假單胞菌也有研究表明具有較好的除臭效果［34-36］，常常應用于污水處理廠污泥臭氣降解，對H2S降解效果最佳，最高達到95.1%，同時對甲硫醇、甲硫醚、NH3等惡臭氣體也有一定的降解效果。本研究中兩菌混合對NH3和H2S的降解效果明顯優于單菌的降解效果，產生協同作用促進NH3和H2S的降解，最終對NH3的降解率達到86.3%，對H2S的降解率達到91.2%，明顯高于單個菌株對NH3和H2S的降解率。

有研究表明［37-38］，垃圾中含有大量的NH4+和S2-，是NH3和H2S的主要產生來源。處于旺盛生長的對數生長期的菌種活性高，因此會大量消耗NH4+，生成硝酸鹽和亞硝酸鹽，同時大量分解S2-，產生硫酸鹽，SO42-離子濃度增加。待細菌逐漸達到衰亡期后，各離子濃度平穩。目前篩選除臭菌株一般都是在48 h之后才能獲得最佳除臭效果，曾蘇等［39］研究的菌株生長的變化在60 h后才趨于穩定，最大值氨氮和硫酸鹽的離子濃度變化為80.05%和65.03%，在72 h后降解效果下降。張鉥孟等［40］研究的一株脫氮硫桿菌中，菌株在48 h后趨于穩定，最大值氨氮和硫酸鹽的離子濃度變化為67.18%和63.85%，低于本研究中兩株菌株的混合效果。本研究篩選的兩株菌在40 h左右趨于穩定，在72 h仍有明顯降解效果。相對其他研究，該混合菌株氨氮降解率和硫酸鹽離子轉化率更高，持續時間更長，因此具有更佳除臭效果。

4 結論

從廚余垃圾中分離出能夠高效降解NH3和H2S的菌株各1株，鑒定菌株CN5屬于腸球菌屬（Enterococcuss sp.），為革蘭氏陽性菌；CS2屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），為革蘭氏陰性菌。菌株最佳除臭條件為：接種量為10%，培養溫度為35℃，初始pH為7，碳氮比25∶1，碳源為蔗糖，氮源為氯化銨。在混合比例為2∶3時，對NH3和H2S的去除效果最佳，且pH值穩定在中性偏酸性，NH3降解率為86.3%，H2S降解率為91.2%。在72 h內，最終氨氮濃度穩定在50.5 mg/L，氨氮降解率為85.3%；硫酸鹽濃度穩定在302.7 mg/L，硫酸鹽生成率為89.2%。